ÖZ

Amaç

Subaraknoid kanama (SAK) insanlarda beyin hasarına ve ölüme yol açan, günümüzde henüz kesin bir tedavisi olmayan bir hastalıktır. SAK’ın patogenezi tam olarak aydınlatılmamış olmakla birlikte erken beyin hasarı (EBH) en önemli neden olarak gösterilmektedir. EBH’nin nedenlerinden bir tanesi de endoplazmik retikulum stresidir (ERS). ERS beyin hücrelerinde apoptoza ve kan-beyin bariyerinin bozulmasına yol açmaktadır. Bu çalışmada deneysel SAK modeli oluşturulmuş sıçanlarda piseatannolün (PST) frontal korteksteki ERS ve apoptoz üzerine etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır.

Gereç ve Yöntem

Çalışmada 8-10 haftalık Wistar Albino sıçanlardan SHAM (n=8), SAK (n=8) ve PST (n=8) olmak üzere üç grup oluşturuldu. SAK ve PST gruplarında, 120 μL otolog arteriyel kan prekiazmatik sisternaya enjekte edilerek SAK modeli oluşturuldu. PST grubuna SAK sonrası 60. dakikada 30 mg/kg PST intraperiteonal uygulandı. Tüm gruplarda SAK öncesi ve sonrası Garcia nörolojik muayene skorlaması yapıldı. SAK’tan 24 saat sonra frontal korteks dokuları alınarak histopatolojik ve genetik analizler gerçekleştirildi.

Bulgular

PST uygulamasının istatistiksel olarak anlamlı düzeyde olmak üzere nörodavranışsal test sonuçlarında iyileşmeye (p<0,01; p<0,05) ve histopatolojik düzeyde piknoz (p<0,001), ödem (p<0,001) ve TUNEL⁺ apoptotik hücre sayısında (p<0,05) azalmaya sebep olduğu gözlendi. SAK grubunda GRP78 (p=0,01), ATF4 (p=0,01) ve CHOP (p<0,05) gen ekspresyon seviyeleri SHAM grubuna göre yüksek bulundu. PST uygulaması SAK’ta artan tüm ERS göstergelerini azaltıcı etki gösterdi. Bu azalma GRP78 için istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,05). PST ayrıca SAK’ta artan p53 (p<0,01) gen ekspresyon değerlerini azaltıcı etki gösterdi.

Sonuç

SAK sonrası artan ERS üzerine PST’nin koruyucu etki gösterdiği anlaşıldı. Bu bulgulardan yola çıkarak, SAK tedavisinde PST’nin destekleyici bir adjuvant ajan olarak kullanım potansiyeli olduğu anlaşıldı.

GİRİŞ

Subaraknoid kanama (SAK), normalde beyin omurilik sıvısı ile dolu olan ve araknoid ile pia mater arasında yer alan bölgeye kan sızması olarak tanımlanır. SAK, yüksek morbidite ve mortalite ile seyreder ve tüm inmelerin %3-10’luk bir kısmından sorumludur¹. SAK en çok 40-60 yaş aralığında görülür, kanama sonrası 1. ayda mortalite oranı %50’ye kadar ulaşır².

SAK patogenezinin altında yatan en temel mekanizma ilk 3 gün içerisinde ortaya çıkan erken beyin hasarıdır (EBH). EBH beyin iskemisi, kan-beyin bariyerinin (KBB) bozulması, beyin ödemi, oksidatif stres, enflamatuvar yolakların aktivasyonu ve nöronal apoptoz dahil bir dizi karmaşık patofizyolojik süreci içerir³. Son yıllarda yapılan çalışmalar endoplazmik retikulum (ER) ve mitokondri gibi hücre içi organellerin fonksiyonlarındaki bozuklukların da SAK patofizyolojisine dahil edilebileceğini göstermiştir⁴. SAK sonrası ortaya çıkan hücre ölümlerinin bir kısmından ER stresinin (ERS) sorumlu olduğu ve ERS’nin endotel hücrelerinin apoptozisine ve KBB’nin bozulmasına kadar gidebilen apoptotik süreçleri başlattığı bilinmektedir⁵. Bu nedenle SAK’ta ERS’yi azaltmaya yönelik çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır.

ERS ER’deki protein katlama kapasitesi ile işlenen protein yükü arasındaki dengenin bozulması olarak tanımlanır⁶. Hücrede sentezlenen polipeptitler sürekli olarak yanlış katlanma veya sitotoksik kompleksler halinde toplanma riski altındadır. Moleküler şaperonlar, proteinin yeniden katlanmasına yardımcı olarak ve protein agregasyonunu önleyerek bu sitotoksisiteyi giderirler⁷. Bu nedenle proteinler sürekli olarak şaperon denetiminden geçerler⁸. ER’de protein katlanmaları, BiP veya diğer adıyla GRP78 (78-kDa glukozla düzenlenen protein) ve GRP94 (94-kDa glukozla düzenlenen protein) gibi ER şaperon proteinleri ve protein disülfid izomeraz ile peptidil-prolil izomeraz gibi enzimler tarafından kolaylaştırılır⁹. ER lümeninde yanlış katlanmış proteinlerin birikmesi ER homeostazındaki değişikliklere ve sonuç olarak ERS’nin uyarılmasına neden olur¹⁰. Yanlış katlanmış veya katlanamamış proteinler, ER içinde bulunan ER ile ilişkili protein degradasyonu (ERAD) kontrol sistemi ile yıkıma uğratılırlar ve böylece protein dengesi korunur¹¹. Bununla birlikte protein dengesini korunmasında bazen ERAD mekanizması yeterli gelmez, böyle durumlarda hücrede katlanmamış protein yanıtı (UPR) ismi verilen yolak aktif hale gelir^12-14. Bu yolak, ER fonksiyonundaki homeostazinin yeniden sağlanması için gerekli önemli bir sinyal mekanizmasıdır¹⁵. Bu yolağın aktivasyonu (a) protein kinaz RNA benzeri ER kinaz (PERK), (b) inositol gerektiren enzim-1 ve (c) aktive edici transkripsiyon faktörü 6 (ATF6) olmak üzere üç temel sensör protein tarafından sağlanır.

ERS ile oksidatif stresin SAK’ta EBH patogenizine katkıda bulunduğu yapılan birçok çalışmada da ifade edilmektedir^{16, 17}. Bu nedenle SAK’ta ERS’nin azaltılması veya tamamen ortadan kaldırılması tedavi seçenekleri arasında değerlendirilmektedir. Bu amaçla birçok molekül üzerinde araştırmalar yoğun bir şekilde devam etmektedir. ERS’nin azaltılması için düşünülen aday moleküllerden bir tanesi de piseatannoldür (PST).

Yaban mersini, üzüm ve çarkıfelek meyvesi tohumlarında yaygın olarak bulunan PST bir resveratrol (RES) hidroksil analoğudur¹⁸. PST, RES’e göre daha yüksek bir biyoyararlanım oranına sahiptir^19-21. Bu durum PST’nin RES’e alternatif bir molekül olarak değerlendirilmesine yol açmıştır. PST’nin tedavi edici yönü sahip olduğu anti-enflamatuvar, anti-oksidatif ve anti-proliferatif etkinliği sayesinde gerçekleşmektedir²². Buna ek olarak yapılan çalışmalarda PST’nin ERS’yi azaltıcı veya ERS’ye karşı koruyucu etkinliği de ortaya konulmuştur^{13, 23}. PST’nin ERS üzerine olan etkileri karaciğer, osteoblast hücreleri, endotelyal hücreler gibi hücre ve organlarda ortaya konulmuştur^{13, 23}. PST’nin ERS üzerine nasıl bir etki gösterdiği henüz araştırılmamıştır.

Bu nedenle çalışmamızda PST’nin SAK’ta frontal korteksteki ERS düzeyi üzerine bir etkisinin olup olmadığının araştırılması amaçlanmıştır.

GEREÇ VE YÖNTEM

Bu çalışma Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu’nun 05.03.2021 tarih ve 2021/02-08 sayılı izni ile yürütüldü. Çalışmanın hayvan deneyleri süreci Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi Deneysel Araştırmalar Uygulama ve Araştırma Merkezi’nde gerçekleştirildi.

Deney Hayvanlarının Seçimi ve Gruplandırılması

Çalışmada, 24 adet 8-10 haftalık 200-300 g ağırlığında Wistar cinsi erkek sıçanlar kullanıldı. Sıçanlar, deneysel süreçte yaklaşık olarak 20±2 °C’lik oda sıcaklığında, 12 saat aydınlık-karanlık döngüsünde ad-libitum olarak beslendi.

Çalışmada kullanılan sıçanlar her grupta 8 sıçan olacak şekilde rastgele üç gruba ayrıldı.

SHAM Grubu (n=8): Bu gruba SHAM SAK modeli yapıldı. Sıçanlara PST içermeyen taşıyıcı solüsyon intraperitoneal (i.p.) yolla uygulandı.

SAK Grubu (n=8): SAK modeli oluşturuldu. Kuyruktan 120 µL heparinize olmayan taze otolog arteriyel kan alındı ve prekiazmatik sisternaya 10 saniye sürede enjekte edildi. Sıçanlara piseatannol içermeyen taşıyıcı solüsyon i.p. yolla uygulandı.

PST Grubu (n=8): SAK modeli oluşturulduktan 60 dakika sonra 30 mg/kg dozunda PST (%2’lik etanol içeren distile su içerisinde çözündürülerek) i.p. yolla enjekte edildi.

Piseatannol Çözeltisi Hazırlanması ve Uygulanması

Sıçanların ağırlıklarına göre belirlenen PST (Cayman Chemical; Cat. no: 10083-24-6) dozu her hayvan için ayrı bir ependorf tüpe konuldu. İlk olarak %99’luk etanol içinde çözündürüldü ve daha sonra distile su ile seyreltildi. Taşıyıcı çözeltinin nihai etanol konsantrasyonu %2 olarak belirlendi. Çözelti enjeksiyondan hemen önce hazırlandı ve taze olarak SAK modeli oluşturulduktan 60 dakika sonra intraperitoneal yolla 30 mg/kg dozunda uygulandı. SHAM ve SAK grubuna PST içermeyen taşıyıcı solüsyon aynı yolla ve aynı saatlerde enjekte edildi.

Subaraknoid Kanama Modeli Oluşturulması

SAK modeli için ilk olarak genel anesteziye (60-80 mg/kg ketamin hidroklorür ve 5 mg/kg ksilazin hidroklorür) alınan sıçanların kafatasının ön bölgesi tıraş edildi. Kuyruk vertikal insizyon ile açıldı ve kuyruktan 120 µL arteriyel kan alındı. Frontal bölge vertikal insizyon ile deri ve kaslar açılarak bregma kemik bileşkesine ulaşıldı. Stereotaksi cihazı kullanılarak iğne sagital düzlemin 2 mm sağına 30 derece yatırıldı ve 1,5 mm çapındaki burr deliği ile orta hatta bregmanın 7 mm önüne yerleştirildi. 120 µL heparinize olmayan taze otolog arteriyel kan, 30 G’lik bir iğne ile prekiazmatik sisternaya 10 saniyede enjekte edildi. İnsizyon bölgesi dikildi ve kapatıldı.

SHAM grubunda SAK modelinin tüm aşamaları gerçekleştirildi, prekiazmatik sisterna’ya 30 G’lik bir iğne ile girildi, 10 saniye beklendi fakat herhangi bir kan enjeksiyonu yapılmadı²⁴.

Nörodavranışsal Değerlendirme

Tüm sıçanlar deneysel uygulamalara başlanılmadan 1 gün önce nörolojik testlere tabi tutuldu. Aynı testler SAK sonrası 24. saatte tekrarlandı. Bu amaçla Garcia nörolojik muayenesi yapıldı.

Garcia Nörolojik Skorunun Belirlenmesi

Nörolojik ve duyusal fonksiyonların değerlendirilmesi amacı ile Garcia’nın geliştirdiği ölçek kullanıldı. Bu amaçla yapılan skorlama SAK’tan 24 saat önce ve 24 saat sonra hayvanların hangi grupta olduğunu bilmeyen iki gözlemci tarafından tarafından gerçekleştirildi²⁵.

Skorlamada spontan aktivite (0-3 puan), dört uzuv hareketinde simetri (0-3 puan), ön pençe uzatma (0-3 puan), tırmanma (1-3 puan), vücut propriosepsiyonu (1-3 puan) ve titreşim duyusu (1-3 puan) olmak üzere altı test toplam skor 3 ile 18 arasında olmak üzere değerlendirildi.

Ötenazi ve Örneklerin Toplanması

Çalışma sonunda (SAK sonrası 24. saatte) tüm sıçanlar anestezi altında servikal dislokasyon işlemi ile ötenazi edildi ve frontal korteksleri soğuk buz bloğu üstünde hızlı bir şekilde çıkarıldı. Her grupta mevcut 8 hayvanın 3’ünün total beyin dokusu beyin ödemi belirlenmesi için kullanıldı. Diğer 5 hayvanın beyin dokuları histopatolojik ve genetik incelenmeler için kullanıldı. Genetik incelemeler için alınan beyin dokuları analiz edilene kadar -80 °C’de saklandı. Histopatolojik incelemeler için alınan beyin dokuları ise analizler için %4’lük formaldehite konuldu.

Beyin Ödemi Tayini

Beyin ödemi belirlemek için total beyinlerin hızlı bir şekilde ıslak ağırlıkları ölçüldü. Daha sonra +70 °C’de 72 saat süre ile etüvde tutuldu. 72 saat sonrasında doku parçaları etüvden çıkarıldı ve kuru ağırlıkları ölçüldü. Islak ve kuru ağırlık oranı (%) olarak belirlendi²⁶.

Beyin Sıvı İçeriği=[(Islak Ağırlık - Kuru Ağırlık) / Islak Ağırlık] x %100

Genetik Analizler

Total RNA İzolasyonu

Genetik analizler frontal korteks dokusunda gerçekleştirildi. Bu amaçla ilk olarak 25-30 mg’lık frontal korteks örnekleri homojenize edildi. PURE Link RNA MiniKit kullanılarak homojenatlardan total RNA izolasyonu yapıldı. Total RNA’ların konsantrasyon ve saflık tayini NanoDrop Spektrofotometre ile belirlendi ve saflık oranı 1,8-2,1 arası değerler arasında belirlenen örnekler cDNA eldesi için kullanılabilir kabul edildi. Elde edilen RNA’lar kullanılıncaya kadar -80 ºC’de saklandı²⁷.

cDNA Eldesi

cDNA eldesi kit prosedürüne göre yapıldı (High Capacity cDNA Revere Transcription Kit, ABD). Elde edilen cDNA’lar polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) cihazında çalışıldı (The Applied Biosystems^®, 2720 Thermal Cycler 96-Well PCR).

Real-Time PCR (qRT-PCR) Uygulaması

cDNA örnekleri çoğaltıldı ve sonrasında kantitatif real-time PCR (qRT-PCR, StepOnePlus™ real-time PCR System) çalışması için kullanıldı. Gen ekspresyon seviyeleri TaqMan (TaqMan^TM Fast Advanced Master Mix, Ampliqon, Litvanya) kullanılarak analiz edildi.

qRT-PCR yönteminde gen ekspresyon seviyelerine bakılan GRP78, PERK, ATF4, CHOP (C/EBP homolog protein), p53 (tümör protein 53) ve NF-kB (nüklear faktör kappa b) genleri için normalizasyon yapıldı. Normalizasyon için b-actin kullanıldı.

Histopatolojik Analizler

Histopatolojik değerlendirmeler için frontal korteks doku örnekleri ilk olarak %4’lük paraformaldehit solüsyonunda tespit edildi. Tespit edilen doku örnekleri kasetlere konularak akan bir su altında 2 saat boyunca yıkandı. Dokulardan suyun uzaklaştırılması için dokular artan derecelerde sırasıyla alkol serilerinden (%60, %70, %80, %90, %96 ve %100) geçirildi. Daha sonrasında dokular parlatılmak için ksilolden geçirildi ve parafine gömüldü. Kesitlere rutin hematoksilen-eozin (HE) boyama prosedürü uygulandı ve boyanan kesitler hücresel piknoz ve ödem açısından mikroskop altında (x100) HE boyama kriterlerine göre skorlandı. Skorlamada Derece 0 (bulgu yok), Derece 1 (hafif), Derece 2 (orta), Derece 3 (şiddetli) ve Derece 4 (ciddi şiddete) olmak üzere 5 farklı derecelendirme kullanılarak yapıldı.

TUNEL Analizi

TUNEL analizi parafin bloklarından lamlara alınan 4 μm kalınlığındaki kesitler üzerinden gerçekleştirildi. Bu amaçla sırası ile, deparafinizasyon, rehidratasyon, endojen peroksidaz aktivitesi bloke edilmesi, pozitif hücrelerin belirlenmesi için amacıyla DAB (diaminobenzidin) kromojen boyama işlemleri kahverengi boyalı hücreler apoptotik olarak kabul edilerek apoptotik indeks (AI) hesaplandı. Hesaplama için “AI = (apoptotik hücre sayısı/toplam hücre sayısı) × 100” formül kullanıldı.

İstatistiksel Analiz

Çalışmada gen ekspresyon düzeylerindeki değişimleri belirlemek için ilk önce qRT-PCR analizinden CP (crossing points) değerleri elde edildi. Elde edilen sonuçlar b-aktine göre normalize edildi ve 2^-ΔΔCT formülü kullanılarak gen ekspresyon düzeyleri hesaplandı²⁸.

Diğer verilerin istatistiksel anlam düzeyleri IBM SPSS 26 yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. Çoklu grup karşılaştırılmasında Kruskal-Wallis testi kullanıldı. İki grup arasındaki karşılaştırma ise Mann-Whitney U testi ile yapıldı. P<0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

BULGULAR

Bu çalışma her grupta 8 hayvan olacak şekilde 24 adet sıçan üzerinden gerçekleştirildi. Deney boyunca gruplarda ölüm gözlenmedi. SAK uygulanan sıçanlarda subaraknoid bölgede şiddetli kanama bulgularına rastlandı. PST grubunda ise subaraknoid bölgede kanamanın azaldığı gözlemlendi. Kanama düzeylerine yönelik herhangi bir hesaplama yapılmadı. Sadece gözlemsel olarak kanamanın varlığı, azlığı veya çokluğu değerlendirildi. Beyin ödemi verileri SHAM grubunda %77,1 SAK grubunda 77,8 ve PST grubunda ise 77,5 olarak belirlendi. Beyin ödemi bulguları açısından gruplar arasında anlamlı bir fark tespit edilmedi.

Garcia Skorlaması

Garcia nörolojik muayenesi ile sıçanların nörolojik fonksiyonları değerlendirildi. SAK öncesi 24. saatte yapılan değerlendirmelerde gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık bulunmadı (p>0,05). Bununla birlikte SAK sonrası 24. saat verilerinin SAK ve SAK+PST grubunda anlamlı düzeyde değiştiği gözlendi (Şekil 1).

Endoplazmik Retikulum Stresi Gen Ekspresyonu Düzeylerindeki Değişimler

ERS’deki SAK sonrası 24. saatteki değişimler ile bu değişimler üzerine PST’nin etkilerini ortaya koymak için çalışmamızda GRP78, PERK, ATF4 ve CHOP gen ekspresyonu düzeyleri incelenmiştir. Bunlardan PERK gen ekspresyon düzeylerinde anlamlı bir değişiklik gözlemlenmezken GRP78, ATF4 ve CHOP gen ekspresyon düzeylerinde istatistiksel olarak anlamlı değişiklikler ortaya çıkmıştır (p<0,05 veya p<0,01; Şekil 2a, 2b, 2c, 2d).

p53 ve NF-kB Gen Ekspresyon Düzeylerindeki Değişimler

Çalışma sonuçları p53 mRNA seviyelerinin SAK grubunda dramatik bir şekilde arttığını ve PST’nin bu artışı güçlü bir şekilde azalttığını göstermiştir (p<0,01). Bununla birlikte NF-kB gen ekspresyon seviyelerinde gruplar arasında anlamlı bir değişikliğe rastlanmamıştır (Şekil 3a, 3b, 3c, 3b).

Hematoksilen-Eozin Boyama Bulguları

Frontal korteks doku örnekleri HE boyama ile hücresel piknoz ve ödem açısından değerlendirildi. SHAM grubunda hücresel piknoz ve ödem bulgusuna rastlanmadı. Hücresel piknoz ve ödem parametrelerinin hem SAK (her iki parametre için p<0,001) hem PST (piknoz: p<0,01; ödem: p<0,001) grubunda SHAM grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı artış gösterdiği belirlendi. Gruplara ait HE boyama örnekleri Şekil 4a, 4b, 4c’de, bu değişikliklere ait skorlama bulguları ve istatistiksel önem düzeyleri ise Şekil 5a ve 5b’de gösterilmiştir.

TUNEL Analizi Bulguları

TUNEL analizi yöntemi ile apoptotik hücre sayıları belirlendi. Elde edilen verilere göre hem SAK hem de PST grubunda SHAM grubuna göre TUNEL pozitif hücre miktarında istatistiksel olarak anlamlı bir artış olduğu anlaşıldı (sırasıyla p<0,01 ve p=0,05). PST tedavisi SAK sonrası artan apoptotik hücre sayısında anlamlı azalmalar göstermiştir (Şekil 6a, 6b, 6c, 6d).

TARTIŞMA

Bu çalışma ile deneysel SAK modeli oluşturulan sıçanlarda frontal korteksteki ERS üzerine PST’nin iyileştirici etkileri ilk kez ortaya konulmuştur. SAK sonrası 60. dakikada PST uygulamasının a) Garcia nörolojik skorunda iyileşmeye b) GRP78, PERK, ATF4 ve CHOP gibi ERS’yi gösteren gen ekspresyon düzeylerinde azalmaya, c) apoptoz ve yangıyı gösteren p53 ve NF-kB gen ekspresyonu seviyelerinde azalmaya d) histopatolojik düzeyde piknoz ve ödem skorunda düzelmeye ve (e) TUNEL pozitif apoptotik hücre sayısında ise azalmaya sebep olduğu belirlenmiştir. Sonuçlar SAK sonrası PST uygulamasının SAK’a bağlı ERS’yi iyileştirebileceğini ve hücre hasarını azaltabileceğini gösteren ilk deneysel bulgulardır.

Çalışmamızda Prunell ve ark.’ndan²⁴ (2003) modifiye edilen SAK modeli uygulandı. Deneysel çalışma sonucunda hayvanların beyin dokuları çıkarıldıktan sonra tüm sıçanlar subaraknoid alanda kan birikimi olup olmadığı yönü ile kontrol edildi. Hem bu gözlem bulguları, hem nörolojik skor verileri hem de genetik ve histopatolojik veriler uyguladığımız SAK modelinin başarılı olduğunu göstermektedir.

Çalışmamızın ıslak/kuru beyin ağırlığı oranı verileri ile literatür verileri arasında farklılık olduğu görülmüştür. Xiong ve ark.²⁹ (2020) SAK modeli oluşturduktan 48 saat sonra sıçanların beyin dokusunu çıkarıp 100 °C’de 48 saat kurutup ıslak/kuru beyin oranını belirlemişlerdir. Çalışma ıslak/kuru beyin oranının SAK grubunda arttığını L-sistein uygulamasının beyin ödemini azalttığını göstermiştir (Xiong ve ark., 2020)²⁹. Yan ve ark.’nın³⁰ (2017) yaptığı çalışmada ise SAK sonrası 72. saatte beyin dokusu çıkarılıp 4 bölüme ayrılmıştır. Her bölüm ayrı ayrı 105 °C’de 72 saat kurutulduktan sonra beyin ödemi ıslak/kuru beyin oran formülü kullanılarak tespit edilmiştir. Çalışmacılar SAK modeliyle bu oranın arttığı göstermiştir³⁰. Qi ve ark.’nın³¹ (2018) yapmış olduğu çalışmada ise sıçanların beyin dokuları SAK sonrası 24. saate çıkarılmış ve 105 °C’de 24 saat kurutularak beyin ödemi oluşup oluşmadığı incelenmiştir. Bu çalışma ile de beyin ödeminin SAK ile arttığı, atorvastatin verilmesinin beyin ödemini azaltıcı etki gösterdiği ortaya konulmuştur. Bizim çalışmamızda da en yüksek ıslak/kuru beyin oranı SAK grubunda belirlenmiş ve PST uygulaması bu oranı azaltıcı etki göstermiştir. Ancak elde edilen veriler açısından gruplar arasında herhangi bir istatistiksel fark ortaya çıkmamıştır. Bunun nedeni uygulanan kan miktarının azlığı olabileceği gibi beyin ödemi verilerinin sadece 3 sıçanda kaydedilmiş olması da olabilir. Diğer taraftan SAK grubundaki beyin dokusu örneklerinde histopatolojik düzeyde ödem tespit ettik. Bu sonuçlar uyguladığımız SAK modelinin histopatolojik düzeyde beyin ödemine yol açtığını ancak total beyin su miktarında anlamlı bir artış yapacak kadar şiddetli olmadığını düşündürmüştür.

Çalışmada SAK modeli oluşturulmadan önce tüm sıçanların nörodavranışsal test bulguları kaydedildi ve SAK sonrası 24. saat verileri ile karşılaştırıldı. Bu amaçla Garcia nörolojik muayene skorları belirlendi. Garcia nörolojik skorları açısından SAK öncesi tüm sıçanların skorları 18 olarak belirlendi. SAK grubunda 24. saatte bu skor 15,5 değerine kadar azaldı. PST uygulanan SAK grubunda ise 16,5 olarak belirlendi. Bu sonuçlar PST uygulamasının SAK sonrası kötüleşen Garcia nörolojik skorunu iyileştirdiğini göstermektedir (Şekil 1). SAK sonrası nörolojik skor kayıtları hemen hemen tüm SAK çalışmalarında belirlenmektedir. Nörolojik skorlardaki bozulma düzeyi hem SAK’ın ortaya çıkıp çıkmadığı hakkında hem de SAK’ın düzeyi hakkında bilgi vermektedir. Diğer taraftan SAK’ta koruyucu veya tedavi edici ajanların nörolojik skorlar üzerine etkileri de incelenmektedir. SAK sonrası nörolojik skor verileri genellikle 24. saatte kaydedilir. Çünkü en anlamlı değişiklikler bu saatte meydana gelir. Tian ve ark.³² (2020) SAK modeli oluşturdukları sıçanlarda Garcia skorlarını 3., 6., 12., 24., 48. ve 72. saatlerde belirlemişler ve en düşük skoru 24. saatte ölçmüşlerdir. Çalışmalarında 6. saatte azalmaya başlayan Garcia skoru 24. saatte 10 değerine kadar azalmış ve sonra tekrar yükselmeye başlamıştır. Garcia skorundaki bu azalmanın bu saatte ortaya çıkan nöronal apoptoza bağlı olabileceğini ileri sürmüşlerdir. Bizim çalışmamızda da benzer şekilde Garcia skorunun en düşük olduğu SAK grubunun en yüksek frontal korteks apoptotik hücre sayısına sahip olduğunu belirledik.

SAK sonrası 24-72. saatlerde beyinde gerçekleşen patolojik olaylar EBH şeklinde tanımlanmaktadır. EBH’nin altında yatan en önemli mekanizma ise nöronal apoptozdur. Nöronal apoptoz SAK sonrası ortaya çıkan nörolojik bozulmaların ve işlev kayıpların ana sorumlusu olarak kabul edilir. Birçok mekanizmanın nöronal apoptozu uyardığı bilinmektedir. Bunlar arasında ROS artması, eksitotoksisite, sinaptik disfonksiyon, bozulmuş protein yıkım sistemleri, ERS, DNA hasarı, mitokondriyal disfonksiyon ve enflamasyon sayılabilir³³. Bu faktörlerden bir tanesi olan ERS son yıllarda SAK sonrası ortaya çıkan nöronal apoptozla ilişkilendirilmiştir. ER işlevlerindeki bozulma katlanmamış proteinlerin birikimine ve sonuç olarak ERS’ye sebep olur. ERS, UPR yolağının aktifleşmesine yol açar. UPR ise PERK ve ATF4 gibi ERS’ye duyarlı proteinleri aktive eder. PERK’in aktivasyonu ER kaynaklı şaperon ve sitokinlerin aktivasyonunu uyarır. Orta düzeyde bir ERS hücrenin hayatta kalmasına yol açarken, ileri düzeyde ve süreklilik arz eden ERS sinir hücresi ölümüne sebep olur. Nakka ve ark.¹⁷ (2016) yaptıkları bir çalışmada, ERS’nin iskemi/reperfüzyona bağlı sinir hücre ölümlerinde rol aldığını göstermişlerdir. Çalışmalarında iskemi/reperfüzyon sonrası beyin dokusunda GRP78, CHOP ve ATF4 gen ekspresyon sevilerinin arttığını ve yüksek düzeyde nöronal hasar ortaya çıktığını belirlediler. UPR’yi azaltmak için seçici bir eIF2a inhibitörü olan salubrinal uyguladıklarında ise nöronal hücre ölümünde anlamlı şekilde azalmalar ortaya çıkmıştır. Başka bir çalışmada ise zonisamidin ERS üzerinden nöronal hücre ölümünü azaltıcı etkisi incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar Parkinson modeli oluşturulan sıçanlarda zonisamidin CHOP ve kaspaz-3 üzerinden ERS’yi azalttığını ve nöronal hasarı engellediğini ortaya koymuştur³⁴.

Nörodejeneratif hastalıkların yanı sıra SAK sonrası artan ERS de nöronal hücre ölümleri ile ilişkilendirilmiştir. Jiang ve ark.³⁵ (2021) sıçanlarda serebral korteks dokusunda SAK sonrası GRP78, CHOP ve kaspaz-12 gen ekspresyon düzeylerinin arttığını böylelikle nöronal hücre ölümünün de arttığını göstermişlerdir. Hidrojence zengin serum fizyolojik verilen sıçanlarda nöronal apoptozun iyileştiğini gösteren bulgular vardır. Tian ve ark.³² (2020) ise yaptıkları bir çalışma SAK sonrası 24. saate TUNEL pozitif apoptotik hücre sayısının arttığı göstermiştir. Araştırmacılar nöronal apoptozdaki artışa GRP78, CHOP, kaspaz-12 ve ASK1 gen ekspresyon düzeylerindeki artışların neden olabileceğini ileri sürmüşlerdir. Bizim çalışmamızda da SAK sonrası ERS’nin göstergesi olan GRP78, PERK, ATF4 ve CHOP gen ekspresyonu düzeylerinde artışlar ortaya çıkmış ve PST uygulaması bu artışlara karşı iyileştirici etki göstermiştir. ERS göstergelerinin arttığı gruplarda hem p53 ile NF-kB hem de apoptotik sinir hücre sayılarının da artmış olduğunu gözlemledik. Bu bulgular literatür bildirimlerine paralel olarak SAK sonrası artan ERS’nin nöronal apoptozu tetiklediğini göstermektedir. PST uygulaması ERS’yi azaltarak nöronal hasarda iyileştirici bir etki göstermiştir.

Çalışmamızda enflamatuvar süreçlerdeki değişimleri gösterebilecek bir parametre olarak NF-kB gen ekspresyonları incelenmiştir. SAK sonrası artan NF-kB gen ekspresyonu düzeylerinin PST uyguladığımız grupta yaklaşık %50 düzeyinde azalmış olması PST’nin enflamatuvar süreçleri inhibe ettiğini düşündürmüştür. PST’nin NF-kB’yi inhibe edici etkisi bir çalışmada ortaya konulmuştur³⁶. Çalışma sonuçlarına göre PST’nin beyin dokusunda ortaya çıkan ve beyin hasarına karşı koruyucu olduğu düşünülen antioksidan ve anti-enflamatuvar etkilerinin NF-kB inhibisyonu ile ilişkili olduğu ileri sürülmüştür. Çalışmada, PST’nin beyin hücreleri üzerine etkisi lipopolisakkaritle indüklenen enflamasyonda incelenmiştir. İn vitro düzeyde yürütülen ve PST’nin KBB’deki bozulmayı azaltarak beyni hasara karşı koruyucu etki gösterebileceği belirtilmiştir. Başka bir çalışmada ise PST’nin beyinde iskemi/reperfüzyon modelinde koruyucu etkileri incelenmiştir³⁷. PST bir SIRT1 aktivatörü olarak bilinir. SIRT1’in aktivasyonu ise antioksidan ve antiapoptotik faktörlerin sentezini uyararak hücreleri hasara karşı korur^{38, 39}. Çalışma sonuçlarından yola çıkılarak beyin iskemi/reperfüzyon modelinde PST’nin gösterdiği antioksidan ve anti-enflamatuvar etkiler SIRT1 aktivasyonu ile ilişkilendirilmiştir³⁷. PST beyin hasarı üzerine koruyucu etki gösterdiğine dair yukarıda verilen çalışmalar bulunmakla birlikte PST’nin SAK’taki etkilerini inceleyen sadece bir adet çalışmaya rastlanılmıştır. Bununla birlikte PST bir RES analoğu olarak bilinir ve RES’in hem beyin hasarı hem de SAK’taki rolü konusunda çalışmalar bulunmaktadır. RES’in SAK modelinde hem çok yüksek hem de düşük dozda uygulandığı bir çalışmada antiapoptotik etkisinin ancak yüksek dozda ortaya çıktığı anlaşılmıştır. Çalışmada RES bu etkisini Akt yolağını inhibe ederek göstermiştir⁴⁰. Başka bir çalışmada ise RES, SAK sonrası artan oksidatif stresle birlikte ERS’yi de azaltıcı etki göstermiştir⁴¹. Çalışmada RES’in etkisi bizim çalışmamıza benzer şekilde prefrontal kortekste incelenmiştir. RES SAK sonrası artan CHOP ve GRP78 düzeylerini anlamlı şekilde azaltıcı etki göstermiştir. SAK’ta artan ROS birikimi ERS’ye ve apoptoza giden süreçleri tetikler. Bir antioksidan olan RES bu özelliği sayesinde ERS’yi azaltıcı etki gösterir. Çalışmamızda RES’e benzer şekilde PST’nin de SAK sonrası artan ERS göstergelerinden CHOP, GRP78, ATF4 ve PERK gen ekspresyon düzeylerini azalttığı anlaşılmıştır. PST aynı zamanda TUNEL pozitif hücre sayılarında da azalmaya sebep olmuştur. Bu veri PST’nin SAK’a bağlı apoptozu da azalttığını göstermektedir.

Çalışmanın Kısıtlılıkları

Çalışmamızda gen ekspresyonlarını belirlediğimiz belirteçlerin protein düzeyleri hesaplanmamıştır. Ayrıca etik kurallar nedeni ile beyin ödemi için sadece 3 sıçan kullanılmıştır.

SONUÇ

Çalışmadan elde ettiğimiz sonuçlar PST’nin SAK sonrası bozulan nörolojik skorları düzelttiğini, apoptozu azalttığını ve ERS’deki bozulmaya karşı koruyucu etki gösterdiğini ortaya koymuştur. Bu sonuçlar, SAK sonrası artan ERS üzerine PST’nin koruyucu etki gösterdiğine dair ortaya konulan ilk bulgulardır. Bu bulgulardan yola çıkarak, SAK tedavisinde PST’nin bir adjuvant ajan olarak kullanım potansiyeli olduğu söylenebilir. Bununla birlikte altta yatan diğer mekanizmaların da ortaya konulması için yeni çalışmalara da ihtiyaç duyulmaktadır.