ÖZET

Amaç:

Bu çalışmanın amacı travmatik omurilik yaralanmasında (T-SCI) diklofenak sodyum (DF) ve montelukast sodyumun (ML) akut enflamasyon üzerindeki koruyucu etkilerini araştırmaktır.

Gereç ve Yöntem:

Kırk Sprague-Dawley sıçanı rastgele beş gruba ayrıldı. Kontrol grubuna herhangi bir müdahale yapılmazken, travma grubuna SCI uygulandı. Kalan üç gruba travma sonrası diklofenak sodyum (tDF), ML (tML) ve tDF+ML intraperitoneal yolla uygulandı. Sıçanlar sakrifiye edildikten sonra hem omurilik hem de dura içeren doku örnekleri histopatolojik incelemeye tabi tutuldu ve ödem, nekroz, enflamatuvar hücreler, apoptoz, nöron hasarı ve kanama açısından skorlandı.

Sonuç:

DF’nin tek başına kullanımı ödem ve enflamatuvar hücre sayısını azaltırken, DF+ML’nin birlikte kullanımının T-SCI’da nekroz, apoptoz ve nöral hasar gelişimini azalttığı saptandı.

Bulgular:

Kontrol ve travma grupları arasındaki histopatolojik değişikliklerde gruplar arasında anlamlı fark bulundu (p<0,05). Travma grubu ve travma+ilaç gruplarının histopatolojik skorları benzerdi (p>0,05). Kontrol grubu ile gruplar arasında ödem farkı olmayan grubun tDF grubu olduğu görüldü (p=0,059). Enflamatuvar hücreler incelendiğinde hücre miktarının en az tDF grubunda olduğu izlendi (p=0,068). Nekroz (p=0,1), apoptoz (p=0,061) ve nöral hasar durumunun (p=0,139) tDF+ML kombine grubunda en az olduğu görüldü. Kanama miktarı açısından gruplar arasında anlamlı bir fark yoktu (p>0,05).

GİRİŞ

Omurilik yaralanması (SCI), omurilik işlevleri üzerinde geçici veya kalıcı etkisi olabilen ve fiziksel, psikolojik ve sosyal olarak yıkıcı sonuçları olan bir durumdur¹. SCI insidansı coğrafi bölgeler arasında ve zamanla değişmektedir. Yıllık insidans oranı milyonda 10,4-83 kişi olarak bildirilmektedir².

Tüm terapötik seçeneklere rağmen, travmatik omurilik yaralanması (T-SCI) ile ilişkili morbidite ve mortalite yüksektir³. Başlangıçta travmaya bağlı mekanik nedenlerle omurilik ve çevre dokuların tutulumu ile birincil yaralanma meydana gelir. Daha sonra çeşitli mekanizmalarla ikincil yaralanma meydana gelir. Progresif ödem, artan iskemi ve tetiklenen proapoptotik yolaklar ek doku hasarına yol açar ve süreç hücre ölümü ile sonuçlanır⁴. Primer yaralanma bu süreçte beklenmedik nedenlerle meydana geldiğinden genellikle önlenemez ve şiddeti değiştirilemez. Bu nedenle ikincil yaralanmayı önlemek veya azaltmak ve iyileştirmek tedavinin ana hedefi olmuştur. Bununla birlikte, ikincil yaralanmanın önlenmesi veya yönetimi için henüz kesin bir yaklaşım yoktur ve çok sayıda ajan araştırılmaktadır⁵. Non-steroid anti-enflamatuvar ilaçlar (NSAİİ) da deneysel ve klinik çalışmalarda kullanılan farmakolojik ajanlar arasındadır.

Enflamasyon, yaralanmaya karşı bir savunma mekanizmasıdır. Ancak enflamatuvar süreçlerin çeşitli faktörlere ve zamana bağlı olarak faydaları olduğu gibi zararlı etkileri de olabilir⁶. NSAİİ, enflamasyonu önleyerek/azaltarak ikincil hasarı azaltmak/iyileştirmek için kullanılır. Montelukast sodyum (ML), mast hücrelerinden salınan araşidonik asit metabolitlerinden lökotrienlerin, eozinofillerin ve enflamasyonda rol oynayan diğer enflamatuvar hücrelerin bulunduğu sisteinil lökotrien reseptörlerine bağlanarak etkilerini azaltan bir lökotrien reseptör antagonistidir⁷. Diklofenak sodyum (DF) ise araşidonik asit metabolizmasında yer alan siklooksijenaz 1 ve 2 (COX-2) enzimlerini inhibe ederek anti-enflamatuvar etki gösterir ve enflamatuvar mediatörlerin sentezini engeller⁸.

Bu çalışmada enflamatuvar ajanlar, DF ve/veya ML T-SCI olgularında akut enflamasyon üzerinde koruyucu etkilerinin olup olmadığını araştırmayı amaçladık. Bu amaçla, deneysel bir T-SCI sıçan modeli oluşturuldu ve ilaçların travmaya bağlı yaralanma üzerindeki etkisini araştırmak için histopatolojik inceleme yapıldı.

GEREÇ VE YÖNTEM

Bu çalışmada, 10-12 haftalık, 230-280 gr ağırlığında 40 erkek Sprague-Dawley rat kullanıldı. Bu çalışma, Sağlık Bilimleri Üniversitesi, Haydarpaşa Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi’nin (protokol no: 2017-05/05, tarih: 01.11.2017) toplantısında Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu tarafından onaylandı. NSAİİ olarak DF (Voltaren, Novartis, İstanbul, Türkiye) ve ML (Singulair, Merck Sharp Dohme, İstanbul, Türkiye) kullanıldı.

Sıçanlar, her biri 8 sıçan içeren 5 gruba ayrıldı:

1. Kontrol grubu (C): SCI yok ve ilaç yok

2. Travma grubu (T): sadece omurilik yaralanması, ilaç yok.

3. Travma+DF grubu (tDF): omurilik yaralanmasından sonra diklofenak uygulaması.

4. Travma+ML grubu (tML): omurilik yaralanmasından sonra montelukast uygulaması.

5. Travma+diklofenak+montelukast grubu (tDF+ML): omurilik yaralanmasından sonra diklofenak+montelukast uygulaması.

Tüm sıçanlar, yeterli hava sirkülasyonu ve ortam sıcaklığı olan odalarda, yiyecek ve su kısıtlaması olmaksızın tutuldu. Omurilik yaralanmasını takiben denekler bakımın sürdürülmesi için uygun bir ortama yerleştirildi, günlük pansumanları yapıldı ve tedavi gruplarındaki deneklere ilgili ilaçlar verildi.

Cerrahi Prosedür

Kontrol grubu dışındaki tüm sıçanlarda SCI oluşturuldu. Cerrahi işlem öncesi genel anestezi için Ketamin 60 mg/kg (Ketalar, Parke-Davis, Eczacıbaşı, İstanbul, Türkiye) ve Xylazine 10 mg/kg (Rompun, Bayer İlaç, İstanbul, Türkiye) uygulandı. Deney tahtalarına yüzüstü pozisyonda sabitlenen sıçanlarda cerrahi prosedürler uygulandı. Cerrahi alan traş edildi ve povidon iyot solüsyonu (Poviod %10 polivinilpirolidon-iyodin kompleksi, Saba İlaç, İstanbul, Türkiye) kullanılarak bölgesel antisepsi sağlandı. Steril örtü ile kapatıldıktan sonra T9-T12 vertebra seviyesinde deri ve deri altı kesiler yapıldı. Paravertebral kasların subperiostal soyulması yapıldı. T9-T10-T11 laminektomi ve flavektomiyi takiben dura açığa çıkarıldı. Ekstradural omurilik yaralanması, Yaşargil Anevrizma Klipsi kullanılarak omuriliğe bir dakikalık kompresyon ile oluşturuldu.

İlaç Uygulaması

DF: İlgili gruplardaki olgulara omurilik yaralanmasından sonra 72 saat süreyle günde iki kez 10 mg/kg DF intraperitoneal yoldan verildi.

ML: İlgili gruplardaki deneklere omurilik yaralanmasından sonra 72 saat süreyle intraperitoneal yoldan günde iki kez 10 mg/kg mL uygulandı.

Takip

Yetmiş iki saatlik medikal tedavi ve takip süresinden sonra denekler 100 mg/kg pentotal sodyum (Pental Sodyum, Ulagay İlaç, İstanbul, Türkiye) kullanılarak sakrifiye edildi. Ameliyat yeri steril şartlarda açıldı ve lezyon bölgesi açığa çıkarıldı. Omurilik, dura ve hem proksimal hem de distal segmentlerden 5 mm sağlam doku içeren çevre dokular birlikte eksize edildi. Bu doku örnekleri %10 formalin solüsyonunda fikse edildikten sonra histopatolojik inceleme için laboratuvara gönderildi. Takip süresi boyunca travma grubundan ve travma+DF grubundan olmak üzere toplam iki olgu öldü.

Histopatolojik İnceleme

Doku örneklerinden elde edilen kesitler hematoksilen-eozin ile boyanarak ışık mikroskobunda ödem, nekroz, enflamatuvar hücreler, apoptoz, nöron yaralanması ve kanama olup olmadığı incelendi ve her bir bulgu Tablo 1’de özetlendiği şekilde derecelendirme sistemi ile puanlandı. Histopatolojik inceleme bulguları Şekil 1’de görülebilir.

İstatistiksel Analiz

İstatistiksel analiz için Number Cruncher Statistical Software 2007 (NCSS, LLC, Kaysville, Utah, ABD) kullanıldı. Tanımlayıcı istatistikler kategorik değişkenler için sayı ve yüzde, sayısal değişkenler için medyan, 25. persantil ve 75. persantil olarak ifade edildi. Normal dağılım göstermeyen çoklu grup karşılaştırmalar Kruskal-Wallis testi, ikili karşılaştırmalar ise Bonferroni düzeltmeli Mann-Whitney U testi kullanılarak yapıldı. İstatistiksel anlamlılık düzeyi p<0,05 olarak kabul edildi.

BULGULAR

Kontrol grubu ile diğer gruplar arasındaki histopatolojik skorlar ve istatistiksel farklar Tablo 2’de özetlenmiştir. Kontrol grubu ile travma grubu arasındaki parametrelerin anlamlı olarak farklı olduğu gözlendi (p<0,05). Travma grubu ve travma+ilaç gruplarının histopatolojik skorları benzerdi (p>0,05). Gruplar arasındaki ödem düzeyleri incelendiğinde, kontrol grubuna göre fark olmayan grubun tDF grubu olduğu (p=0,059) ve anlamlı farklılık gösteren grupların sırasıyla tDF+ML grubu (p=0,034) ve tML grubu (p=0,007) olduğu görüldü. En az ödemin tDF grubunda olduğu görüldü. Nekroz değerlendirmesinde en az nekrozlu grup tDF+ML (p=0,1) iken, daha fazla nekrozlu gruplar tDF (p=0,017) ve tML (p=0,008) idi. Enflamatuvar hücre sayısı dikkate alındığında en düşük hücre sayısı tDF grubunda (p=0,068), daha fazla hücre sırasıyla tDF+ML grubunda (p=0,035) ve tML grubunda (p=0,002) gözlendi. En az apoptozisi olan grup tDF+ML iken (p=0,061) tDF grubunda (p=0,039) ve tML grubunda (p=0,004) anlamlı olarak daha yüksek bulundu. En az tDF+ML grubunda (p=0,139), nöronal hasar görülürken, tDF grubunda (p=0,011) ve tML grubunda (p=0,005) anlamlı düzeyde nöral hasar gözlendi. Preparatlardaki kanama miktarına bakıldığında tüm gruplarda kontrol grubuna göre anlamlı kanama olduğu görüldü (p<0,05).

TARTIŞMA

T-SCI’ler, hastaların yaşamlarında yıkıcı fiziksel, psikolojik ve sosyal sonuçlara yol açabilen klinik durumlardır. Ancak tüm araştırmalara ve günümüzde uygulanan tedavi yöntemlerine rağmen kesin bir tedavi yöntemi geliştirilememiştir¹. Primer hasarın şiddeti, T-SCI’nın prognozunu belirlemede en kritik faktördür. Bununla birlikte, ikincil yaralanmaya neden olan mekanizmalar, yaralanmayı şiddetlendirebilir veya iyileşme süreçlerini etkileyebilir ve dolayısıyla genel morbidite ve mortaliteyi etkileyebilir.

Enflamasyon ikincil hasarda kritik bir role sahiptir. Enflamasyonun amacı, var olan hasarı stabilize etmek ve sınırlamak, organizmanın tamiri için gerekli şartları yerine getirmek, hücre kalıntılarını temizlemek ve ortamdaki zararlı maddeleri uzaklaştırmaktır. Şiddetin yüksek olduğu durumlarda, hasarın artması ile nöronal hücre hasarı artabilir ve bunun sonucunda fonksiyonel sonuçlar kötüleşebilir^9,10. İkincil hasarın mekanizmaları karmaşıktır ve nörojenik şok, kanama, iskemi-reperfüzyon, eksitotoksisite, kalsiyum aracılı süreçler, sıvı-elektrolit dengesizliği, immünolojik süreçler, apoptoz ve mitokondriyal disfonksiyon gibi çeşitli durumları içerir¹¹. Şimdiye kadar, SCI tedavisi için çeşitli tıbbi ajanlar araştırılmıştır. Bu ajanlar arasında kortikosteroidler, vazopresörler, minosiklin, magnezyum, riluzol, gliburid (glibenklamid), tirotropin salgılatıcı hormon, opioid reseptör antagonistleri (nalokson), granülosit koloni uyarıcı faktör, setrin, gangliosidler, antioksidanlar, kalsiyum kanal blokerleri, sodyum kanal blokerleri ve diğerleri bulunmaktadır^12,13. Kortikosteroidler, anti-enflamatuvar, ödem çözücü ve antioksidan özelliklerinden dolayı birçok deneysel ve klinik çalışmada uzun süredir kullanılmaktadır. Bununla birlikte, 6-12 aylık takipte kortikosteroidlerin plaseboya kıyasla hiçbir etkisinin olmadığı ve bu nedenle uzun vadeli faydalarının olmadığı şu anda kabul edilmektedir¹⁴.

NSAİİ’lerin güçlü anti-enflamatuvar etkileri nedeniyle ikincil hasarda anti-enflamatuvar etkilere sahip olmaları beklenmektedir. Deneysel çalışmalarda apoptozu azaltarak ve histolojik iyileşme sağlayarak RhoA yolağının inhibisyonu ve nöroprotektif etkisi bu ilaçları tedavi açısından umut verici bir konuma getirmektedir¹⁵. Çalışmamızda gruplar arası ödem düzeyi incelendiğinde kontrol grubundan farklılık göstermeyen grubun tDF grubu olduğu görüldü. ML grubunda ödem açısından anlamlı fark yoktu. Ayrıca tDF+tML grubu ile diğer ilaç grupları karşılaştırıldığında, kombine ilaç uygulamasının tekli uygulamalara göre anti-ödem etkiyi azalttığı bulundu. Saiwai ve ark.’nın¹⁶ çalışmasında SCI sonrası yaralanma mekanizmalarında lökotrienlerin önemi vurgulanmıştır. Cavus ve ark.’nın¹⁷ yaptığı çalışmada, etkileri montelukast ve metilprednizolon ile karşılaştırılmış ve nöroprotektif olduğu bildirilmiştir. Genovese et al.¹⁸ montelukast ve ziluetonun etkilerini karşılaştırmış ve anti-ödem etkilerini anlamlı bulmuşlardır.

Enflamasyon organizmanın temel savunma mekanizmasıdır ve travma sonrası 3. saatte travma bölgesinde ortaya çıkmaya başlar ve 3. güne kadar maksimum seviyede kalabilir¹⁹. Schwartz²⁰ aksonal hasar sonrası onarım için nötrofillerin varlığının önemini ve savunma ve onarım olayları için ortamdaki T-lenfositlerin gerekli olduğunu bildirmişlerdir. Schwab ve ark.²¹ beyin omurilik sıvısındaki araşidonik asit metabolitleri olan LTC4 ve TXA2 miktarının yaralanma sonrası normalden 5-9 kat daha fazla arttığını belirtmişlerdir. Çalışmamızda gruplardaki enflamatuvar hücre sayıları karşılaştırıldığında hücre sayısının tDF grubunda en düşük seviyede olduğu görüldü. Diğer gruplarda anlamlı bir fark bulunamadı. Hains ve ark.²² COX-2 inhibitörlerinin histolojik ve motor fonksiyon sonuçlarını iyileştirdiğini bulmuşlardır. Literatürde indometasin ve ketorolakın intratekal olarak uygulandığı çalışmalarda koruyucu etkisinin olduğu bildirilmiştir^23,24. Genovese ve ark.¹⁸ ayrıca 5-lipoksijenaz inhibitörleri olan zileuton ve ML, travma sonrası 24 saat içinde artan enflamatuvar hücre sayısını ve miyeloperoksidaz aktivitesini azalttığını göstermişlerdir.

Gruplar arası karşılaştırmalar sonucunda tDF+ML’nin birlikte kullanıldığı grupta, diğer gruplara göre nekroz, apoptoz ve nöral hasarın en az olduğu görüldü. Travma sonrası 6. saatte lezyon merkezinde kaspaz-8 ve 9’un aktive olduğu ve bu aktivitenin 7 gün sürdüğü gösterilmiştir²⁵. Enflamatuvar sitokinler, özellikle nöronlardan salınan TNF-, RhoA yolağını aktive eder ve apoptoza neden olur²⁴. Mills ve ark.²⁶ aktive olan Rho yolağının Bcl-2’ye bağlı apoptozu indüklediğini göstermişlerdir. Xing ve ark.²⁷ posttravmatik 5 gün boyunca NSAİİ tedavisi uyguladıkları ratlarda RhoA inhibisyonunun özellikle oligodenrositleri apoptozdan koruduğunu ve lezyonun rostral ve kaudalinde aksonal miyelinizasyonu artırdığını belirtmişlerdir. Sıçanlar üzerinde yapılan deneysel çalışmada, Wang ve ark.²⁸ 1-28 gün süreyle 60-70 mg/kg dozunda verilen ibuprofen tedavisinin omuriliğin rostral aksonlarında koruyucu etki gösterdiğini, ancak kaudal liflerde bu etkinin gözlenmediğini bildirmişlerdir. Sonuç olarak ibuprofenin potansiyel bir ajan olabileceğini belirtmişlerdir. Sharp ve ark.²⁹ travma sonrası 42 gün boyunca 60 mg/kg ibuprofen tedavisinin sıçanlarda tedavi sonucunda Basso-Beattie-Bresnahan skorunda iyileşme ve motor fonksiyonlarda koruma sağladığını bulmuşlardır.

Travma sonrası kanama, birincil yaralanmadan sonra ortaya çıkan ve ikincil yaralanma ile devam eden bir patolojidir. Noble ve Wrathall³⁰ yaptıkları çalışmada, SCI sonrası kanamanın lokalizasyonunun primer yaralanmaya neden olan darbenin şiddeti ve yönü ile ilişkili olduğunu belirtmişler ve omuriliğin rostral ve kaudal bölgelerinde ve birden fazla bölgede aynı anda kanama lokalizasyonlarının görülebildiğini bildirmişlerdir. Erşahin ve ark.³¹ ML omurilik beyaz maddesindeki kanamayı azalttığını rapor etmişlerdir. Saiwai ve ark.¹⁶ travma sonrası 12. saatte ortama göç eden nötrofillerin kanama durumunu artırdığını ve bir LTB4 antagonisti olan ONO-4057 kullanımı sonrası hücre göçünün azalmasına bağlı olarak bu durumun azaldığını bildirmişlerdir. Çalışmamızda kanama miktarı açısından gruplar arasında anlamlı bir fark olmadığı saptandı.

Çalışmanın Kısıtlılıkları

Çalışmamızın en önemli limitasyonu, patolojik değişikliklerin araştırılmasının yanında fonksiyonel iyileşme ve apoptozis, enflamasyon belirteçleri gibi biyokimyasal parametreler ile desteklenmemesidir.

SONUÇ

Çalışmamızda travmatik omurilik yaralanmasında tek başına DF uygulamasının ödem gelişimini ve enflamatuvar hücre sayısını azaltıcı, DF+ML uygulamasının ise nekroz gelişimini, apoptoz ve nöral hasarı azaltıcı etkisi olduğu belirlendi.

Teşekkür

Namık Kemal Üniversitesi Patoloji Anabilim Dalı’ndan Doç. Dr. Meltem Öznur’a makalemizin yazım sürecindeki desteklerinden dolayı teşekkür ederiz.

Etik

Etik Kurul Onayı: Bu çalışma Sağlık Bilimleri Üniversitesi, Haydarpaşa Numune Eğitim ve Araştırma Hastanesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (protokol no: 2017-05/05, tarih: 01.11.2017).

Hasta Onayı: Bu çalışma hayvanlar üzerinde yapılmıştır.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu dışında olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir. 

Yazarlık Katkıları

Cerrahi ve Medikal Uygulama: T.E., D.C., F.V.A., Konsept: T.E., B.E., Dizayn: T.E., M.İ., F.V.A., Veri Toplama veya İşleme: T.E., D.C., F.V.A., Analiz veya Yorumlama: T.E., F.V.A., T.T., T.Ç., Literatür Arama: T.E., M.İ., B.E., Yazan: T.E., M.İ., B.E., T.T., T.Ç.

Çıkar Çatışması: Yazarlar bu makale ile ilgili olarak herhangi bir çıkar çatışması bildirmemiştir.

Finansal Destek: Çalışmamız için hiçbir kurum ya da kişiden finansal destek alınmamıştır.