ÖZET

Gereç ve Yöntem:

Deneysel yağlanma modeli oluşturmak için, HepG2 hücreleri 1 mM palmitat ile 24 saat inkübe edildi. Tedavi olarak palmitat ile aynı anda hücre kültürü medyumuna, HepG2 hücrelerine toksik olmayan RA konsantrasyonları eklendi. Hücre canlılığı 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolium bromür testi ile değerlendirildi. Yağlanmanın değerlendirilmesi için hücre içi trigliserid düzeyleri ölçüldü ve hücreler Oil-Red O ile boyanarak mikroskopik olarak incelendi. PON1 ve PON3 protein düzeyleri Western blot yöntemiyle ölçüldü.

Amaç:

Palmitat ile non-alkolik yağlı karaciğer hastalığı modeli oluşturulan HepG2 hücrelerinde rosmarinik asitin (RA) hücre canlılığına, yağlanmaya, paraoksonaz (PON) 1 ve PON3 protein düzeylerine etkisini araştırmayı amaçladık.

Sonuç:

Çalışmamız, RA’nın palmitat ile NAFLD modeli oluşturulan HepG2 hücrelerinde hücre canlılığını artırdığını, yağlanmayı azalttığını, ancak PON1 ve PON3 protein düzeylerini değiştirmediğini gösterdi.

Bulgular:

1 mM palmitat hücre canlılığında anlamlı bir azalmaya ve trigliserid düzeylerinde anlamlı bir artışa yol açtı, PON1 ve PON3 protein düzeylerini ise anlamlı olarak değiştirmedi. Palmitat ile oluşturulan deneysel non-alkolik yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) modelinde RA, hücre canlılığını anlamlı olarak artırdı ve trigliserid düzeylerini anlamlı olarak azalttı. Oil-Red O ile boyanan hücrelerin mikroskopik incelenmelerinde hücrelerin trigliserid düzeylerindeki değişimler ile benzer bulgular görüldü. RA hem palmitat uygulanmayan hem de palmitat uygulanan HepG2 hücrelerinde PON1 ve PON3 protein düzeylerini anlamlı olarak değiştirmedi.

GİRİŞ

Non-alkolik yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD), alkol kullanım alışkanlığı bulunmayan bireylerde, farklı derecelerde karaciğer yağlanmasının varlığı ile karakterize bir hastalıktır. NAFLD, dünya genelinde yaklaşık %25 civarında olduğu tahmin edilen görülme sıklığı ile önemli sağlık sorunlarından biridir. NAFLD hastalarında hepatositlerin içinde trigliserid birikimi artmaktadır^1,2. On altı karbonlu doymuş bir yağ asidi olan palmitat karaciğerde trigliseridlerin yapısında bulunur ve hem sağlıklı bireylerin hem de NAFLD hastalarının karaciğerlerinde en fazla bulunan yağ asitlerinden biridir³.

NAFLD, sadece karaciğer ile sınırlı bir hastalık olmayıp multisistemik bir hastalıktır. NAFLD’nin metabolik sendrom ve ateroskleroz ile ilişkili olduğu da gösterilmiştir^4,5. Paraoksonaz (PON) 1 ve PON3 enzimleri esas olarak karaciğerde sentezlenen antiaterojenik enzimlerdir. PON1 ve PON3 karaciğerden dolaşıma sekrete edilirler ve dolaşımda yüksek dansiteli lipoproteine (HDL) bağlı olarak taşınırlar⁶.

HepG2 hücreleri, ticari olarak satılan, insan kaynaklı hepatoma hücreleridir ve bu hücreler hepatositlere benzerlikleri sebebiyle serbest yağ asitleri ile deneysel NAFLD modeli oluşturmak için sıklıkla kullanılmaktadır^7-10. HepG2 hücrelerinde 1 mM palmitat ile oluşturulan yağlanmanın, yağ birikimine bağlı olarak karaciğer hücresindeki akut ve toksik etkilerin araştırılmasında kullanılabilecek bir hücresel NAFLD modeli olduğu bildirmiştir⁷.

Rosmarinik asit (RA), L-fenilalanin ve L-tirozin aminoasitlerinden sentezlenen kafeik asitin ve 3,4 dihidroksifenillaktik asitin esteri fenolik asittir¹¹. RA, doğada biberiye, adaçayı ve perilla biftek otu gibi bitkilerde bulunan, antioksidan ve antienflamatuvar etkileri gösterilmiş bir polifenoldür¹². Literatürde, RA’nın PON1 ve PON3 enzimleri üzerine etkisini araştıran bir çalışmaya rastlamadık.

Bu çalışmada, palmitat ile hücresel NAFLD modeli oluşturulan insan kaynaklı hepatoma hücrelerinde RA’nın, hücre canlılığına, yağlanmaya, PON1 ve PON3 protein düzeylerine etkisinin araştırılması amaçlandı. Bu çalışma ile RA’nın hem direkt olarak uygulandığında hem de NAFLD’de PON1 ve PON3 düzeylerine etkisi ilk kez gösterilmiştir.

GEREÇ VE YÖNTEM

Kimyasal ve Sarf Malzemeler

RA, sodyum palmitat, 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolium bromür (MTT) ve Oil Red O, Sigma-Aldrich’ten (St. Louis, MO, ABD) temin edildi. Eagle’nin minimum esansiyel medyumları, Wisent’ten (St-Bruno, QC, Kanada) temin edildi. Fetal sığır serumu (FBS), antibiyotik-antimikotik ve kemilüminesans substrat, Thermo Fisher’dan (Waltham, MA, ABD) temin edildi. PON1, PON3 ve alfa tübülin primer antikorları ve sekonder antikorlar, Abcam’dan (Cambridge, İngiltere) temin edildi. Yağ asiti içermeyen sığır serum albümini Gold Biotechnology’den (MO, ABD) temin edildi. Radyo immünopresipitasyon lizis tamponu (RIPA), Santa Cruz’dan (Heidelberg, Almanya) temin edildi. Poliviniliden diflorid (PVDF) membran Bio-Rad’dan (Hercules, CA, ABD) temin edildi. Tüm kimyasallar analitik saflıktaydı.

Hücre Kültürü Uygulamaları

Bu çalışma Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Dekanlığı Bilimsel Araştırmalar Etik Kurulu tarafından 29.03.2017 tarihinde TÜTF-BAEK 2017/95 protokol kodu ve 06/05 karar no ile onaylandı. Hücreler %10 FBS ve %1 antibiyotik-antimikotik içeren Eagle’nin minimum esansiyel medyumu ile %5 CO₂’li ortamda 37 °C’de inkübatörde yaşatıldı. Deneylerde 10-20 hücre pasajları kullanıldı.

Yağlanma oluşturmak için HepG2 hücreleri 1 mM palmitat ile 24 saat inkübe edildi^7-9. Sodyum palmitat steril su ile 70 °C’de çözüldü^13,14 ve insan serum konsantrasyonları ile benzer konsanstrasyonda, medyumda çözülmüş, 0,7 mM yağ asidi içermeyen sığır serum albümini ile en az 3 saat konjuge edilerek¹⁵ hücrelere 24 saat süreyle uygulandı. Kontrol grubuna ise sadece 0,7 mM albümin içeren medyum uygulandı.

MTT Testi

Hücre canlılığının değerlendirilmesi için MTT testi yapıldı¹⁶. Doksan altı kuyucuklu plakalara 10⁴ hücre ekildi. RA tek başına ve 1 mM palmitat ile birlikte farklı konsantrasyonlarda 24 saat süreyle hücrelere uygulandı. Yirmi dört saat sonra medyum alınarak yerine 10 µL tuzlu fosfat tamponu (PBS) içerisinde çözülmüş MTT (5 mg/mL) ve 100 µL fenol red içermeyen Eagle’nin minimum esansiyel medyumu konuldu ve 4 saat inkübe edildi. MTT içeren medyum alınarak oluşan formazan 200 µL dimetil sülfoksit ve 25 µL Sorenson tamponu (0,1 M glisin ve 0,1 M sodyum klorür; 0,1 M sodyum hidroksit ile pH: 10,5’e ayarlandı) ile çözüldü ve oluşan renk mikroplaka okuyucuda spektrofotometrik olarak 570/630 nm’de ölçüldü¹⁷. Ölçülen absorbanslar aynı plakadaki kontrol grubunun ortalamasına bölünürek, sonuçlar kontrol grubunun yüzdesi olarak verildi.

Trigliserid Ölçümü

Trigliserid ölçümleri için hücreler 25 cm² flasklara ekildi. Farklı RA konsantrasyonları 1 mM palmitat ile aynı anda hücrelere 24 saat süreyle uygulandı. 24 saat sonunda PBS ile yıkanan hücreler, daha sonra %1 proteaz inhibitörü ve %0,1 Triton X-100 içeren PBS tamponu ile kazındı. Cam bilyeler kullanılarak homojenize edildikten sonra homojenat 10.000 g’de 10 dakika santrifüj edildi. Üst kısımdaki süpernatant deneylerde kullanıldı. Hücre içi trigliserid düzeyleri otoanalizörün orijinal kitleri kullanılarak ölçüldü. Lowry ve ark.’nın¹⁸ yöntemine göre protein ölçümü yapılarak sonuçlar proteine oranlandı ve kontrol grubunun ortalamasına oranlanarak kontrol grubunun katı olarak verildi.

Oil Red O Boyama

Oil Red O ile boyama için hücreler 6 kuyucuklu plakalara ekildi. Farklı RA konsantrasyonları, 1 mM palmitat ile aynı anda hücrelere 24 saat süreyle uygulandı. Yirmi dört saat sonunda hücreler PBS ile yıkandı, %10 paraformaldehit ile fikse edildi. Fiksasyon sonrası %60 isopropanol ile yıkanıp %60 isopropanol içeren Oil Red O [stok %0,35 (w/v) oil red O %100 isopropanolda çözünen] ile inkübe edildi ve distile su ile yıkanarak faz kontrast invert mikroskobu altında mikroskop görüntü yansıtıcı kullanılarak fotoğraflandı⁹.

Western Blot Yöntemi

Hücreler 75 cm² flasklara ekildi. Farklı RA konsantrasyonları, 1 mM palmitat ile aynı anda hücrelere 24 saat süreyle uygulandı. Deneysel prosedür sonrası PBS ile yıkanan hücreler, proteaz inhibitör kokteyli, fenil metil sulfonil florid ve sodyum orto vanadat çözeltilerinden %1 oranında içeren RIPA ile kazındı. Cam bilyeler kullanılarak homojenize edildikten sonra homojenat 10.000 g’de 10 dakika santrifüj edildi. Üst kısımdaki süpernatant deneylerde kullanıldı. Protein ölçümü Lowry ve ark.’nın¹⁸ yöntemine göre yapıldı. Laemmli¹⁹yöntemine göre %4-12 poliakrilamid jel hazırlanarak, 20 µg protein dikey sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi ile ayrıldı. Jeller yarı ıslak aktarım sistemi ile PVDF membrana aktarıldı. Membranlar %5 süt tozu ile 1 saat bloklandı, primer antikorlar (PON1 ve PON3 için 1:1.000, tübülin 1:10.000 dilüsyon) ile gece boyu 4 °C’de inkübe edildi. Ardından 1 saat sekonder antikor (1:10.000 dilüsyon) ile inkübe edilen membranlar, kemilüminesans substrat kullanılarak görüntülendi. Her bir protein için bant yoğunluğu Image J programı kullanılarak hesaplandı²⁰. PON1 ve PON3 proteinleri aynı numunenin yükleme kontrolü olarak kullanılan alfa tübülin protein düzeyine oranlandı ve sonuçlar aynı membrandaki kontrole oranlanarak kontrolün katı olarak verildi.

İstatistiksel Analiz

İstatistiksel analizler Statistical Package for the Social Sciences 20 programı kullanılarak gerçekleştirildi. Deney parametrelerinin karşılaştırılması için one-way ANOVA analizi ve gruplar arası karşılaştırma için Tukey ve Tamhane testleri kullanıldı. Sonuçlar ortalama±standart sapma olarak ifade edildi ve p<0,05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

BULGULAR

HepG2 hücrelerine 24 saat süreyle RA uygulanması sonrası hücre canlılıkları; kontrol grubunda %100±3, 5 µM RA uygulanan hücrelerde %96±6, 10 µM RA uygulanan hücrelerde %106±8, 25 µM RA uygulanan hücrelerde %107±6, 50 µM RA uygulanan hücrelerde %122±9, 100 µM RA uygulanan hücrelerde %131±8, 200 µM RA uygulanan hücrelerde %119±8, 300 µM RA uygulanan hücrelerde %77±7, 400 µM RA uygulanan hücrelerde %73±5 ve 500 µM RA uygulanan hücrelerde %68±6 olarak bulundu. 5, 10 ve 25 µM RA hücre canlılığını kontrol grubuna göre anlamlı olarak değiştirmedi (tümü için p>0,05). 50, 100 ve 200 µM RA hücre canlılığını kontrol grubuna göre, 5, 10 ve 25 µM RA’ya göre anlamlı olarak artırdı (tümü için p<0,05). 200 µM RA hücre canlılığını 100 µM RA’ya göre anlamlı olarak azalttı (p<0,05). 300, 400 ve 500 µM RA hücre canlılığını kontrole göre, 5, 10, 25, 50, 100 ve 200 µM RA’ya göre anlamlı olarak azalttı (tümü için p<0,05) (Şekil 1).

HepG2 hücrelerine 24 saat süreyle uygulama sonrası hücre canlılıkları; kontrol grubunda %100±6, sadece 1 mM palmitat uygulanan hücrelerde %54±4; 1 mM palmitat ile birlikte 5 µM RA uygulanan hücrelerde %54±6, 10 µM RA uygulanan hücrelerde %55±6, 25 µM RA uygulanan hücrelerde %59±6, 50 µM RA uygulanan hücrelerde %66±6, 100 µM RA uygulanan hücrelerde %75±7 ve 200 µM RA uygulanan hücrelerde %83±5 olarak bulundu. 1 mM palmitat uygulanan tüm hücrelerde hücre canlılığı kontrol grubuna göre anlamlı olarak azaldı (tümü için p<0,05). 1 mM palmitat ile birlikte 50 µM RA uygulaması, hücre canlılığını sadece 1 mM palmitat ve 1 mM palmitat ile birlikte 5 ve 10 µM RA uygulamalarına göre anlamlı olarak artırdı (tümü için p<0,05). 1 mM palmitat ile birlikte 100 µM RA uygulaması, hücre canlılığını sadece 1 mM palmitat ve 1 mM palmitat ile birlikte 5, 10 ve 25 µM RA uygulamalarına göre anlamlı olarak artırdı (tümü için p<0,05). 1 mM palmitat ile birlikte 200 µM RA uygulaması, hücre canlılığını sadece 1 mM palmitat ve 1 mM palmitat ile birlikte 5, 10, 25 ve 50 µM RA uygulamalarına göre anlamlı olarak artırdı (tümü için p<0,05) (Şekil 2).

HepG2 hücrelerine 24 saat süreyle uygulama sonrası trigliserid düzeyleri; kontrol grubunda 1,00±0,07, sadece 1 mM palmitat uygulanan hücrelerde 2,54±0,06; 1 mM palmitat ile birlikte 5 µM RA uygulanan hücrelerde 2,55±0,04, 10 µM RA uygulanan hücrelerde 2,47±0,12, 25 µM RA uygulanan hücrelerde 2,44±0,15, 50 µM RA uygulanan hücrelerde 2,27±0,05, 100 µM RA uygulanan hücrelerde 1,94±0,17 ve 200 µM RA uygulanan hücrelerde 1,77±0,27 olarak bulundu. 1 mM palmitat uygulanan tüm hücrelerde trigliserit düzeyleri kontrol grubuna göre anlamlı olarak arttı (tümü için p<0,05). 1 mM palmitat ile birlikte 50 µM RA uygulaması, trigliserid düzeylerini sadece 1 mM palmitat ve 1 mM palmitat ile birlikte 5 µM RA uygulamalarına göre anlamlı olarak azalttı (her ikisi için p<0,05). 1 mM palmitat ile birlikte 100 µM RA uygulaması, trigliserid düzeylerini sadece 1 mM palmitat ve 1 mM palmitat ile birlikte 5, 10 ve 25 µM RA uygulamalarına göre anlamlı olarak azalttı (tümü için p<0,05). 1 mM palmitat ile birlikte 200 µM RA uygulaması, trigliserid düzeylerini sadece 1 mM palmitat ve 1 mM palmitat ile birlikte 5, 10 ve 25 µM RA uygulamalarına göre anlamlı olarak azalttı (tümü için p<0,05) (Şekil 3A).

Palmitat ile yağlanma oluşturulan HepG2 hücrelerinde RA’nın yağlanma üzerine etkisi mikroskopik olarak Oil Red O boyama ile incelendi. 1 mM palmitat uygulanan hücrelerde Oil Red O ile boyanmanın kontrol grubuna göre fazla olduğu görüldü. 1 mM palmitat ile birlikte uygulanan RA konsantrasyonlarının Oil Red O ile boyanmayı azalttığı ve bu azalmanın özellikle yüksek konsantrasyonlarda daha belirgin olduğu görüldü (Şekil 3B).

HepG2 hücrelerine 24 saat süreyle RA uygulaması sonrası PON1 protein düzeyleri; 100 µM RA uygulanan hücrelerde kontrolün 1,11±0,13 katı, 200 µM RA uygulanan hücrelerde kontrolün 1,07±0,07 katı olarak bulundu. HepG2 hücrelerine 24 saat süreyle uygulama sonrası PON3 protein düzeyleri; 100 µM RA uygulanan hücrelerde kontrolün 1,12±0,16 katı, 200 µM RA uygulanan hücrelerde ise kontrolün 1,25±0,28 katı olarak bulundu. 100 µM ve 200 µM RA uygulanan ve kontrol hücreleri arasında PON1 ve PON3 düzeyleri açısından anlamlı fark yoktu (tümü için p>0,05) (Şekil 4A).

HepG2 hücrelerine 24 saat süreyle 1 mM palmitat ile birlikte RA uygulaması sonrası PON1 düzeyleri, sadece 1 mM palmitat uygulanan hücrelerde kontrol grubunun 0,94±0,05 katı; 1 mM palmitat ile birlikte 100 µM RA uygulanan hücrelerde kontrol grubunun 1,01±0,10 katı ve 200 µM RA uygulanan hücrelerde kontrol grubunun 0,92±0,05 katı bulundu. PON3 düzeyleri ise, sadece 1 mM palmitat uygulanan hücrelerde kontrol grubunun 1,03±0,11 katı; 1 mM palmitat ile birlikte 100 µM RA uygulanan hücrelerde kontrol grubunun 0,95±0,08 katı ve 200 µM RA uygulanan hücrelerde kontrol grubunun 1,04±0,17 katı bulundu. 1 mM palmitat, 1 mM palmitat ile birlikte 100 µM ve 200 µM RA uygulanan ve kontrol hücreleri arasında PON1 ve PON3 protein düzeyleri açısından anlamlı fark yoktu (tümü için p>0,05) (Şekil 4B).

TARTIŞMA

NAFLD, etkileri sadece karaciğer ile sınırlı olmayan multisistemik bir hastalıktır ve tüm dünyada görülme sıklığı gittikçe artan önemli bir sağlık sorunudur^4,21. NAFLD, aterojenik dislipidemi için bağımsız risk faktörüdür ve ateroskleroz ile ilişkili olduğu da gösterilmiştir^2,5. NAFLD tedavisinde öncelikle diyet ve egzersiz önerilmekle birlikte antioksidan tedavinin, özellikle E vitamininin de bu hastalarda tedaviye eklenebileceği bildirilmektedir^1,22. RA, bitkisel kaynaklı bir polifenoldür, oksidatif hasara karşı koruma sağlar ve serbest radikalleri temizler^12,23. NAFLD hastalarında en sık görülen ölüm nedeni kardiyovasküler hastalıklara bağlı olarak görülmektedir²⁴. PON1 ve PON3 enzimleri esas olarak karaciğerde sentezlenen antioksidan enzimlerdir. Bu enzimler dolaşımda HDL’nin yapısında yer alarak ateroskleroz gelişiminin önlenmesinde görev alırlar⁶.

Çalışmamızın amacı, palmitat ile deneysel NAFLD modeli oluşturulan HepG2 hücrelerinde RA’nın, hücre canlılığına, yağlanmaya, PON1 ve PON3 protein düzeylerine etkisini araştırmaktı.

RA’nın HepG2 hücrelerinde hücre canlılığı üzerine etkisi ile ilgili literatürde çelişkili sonuçlar bulunmaktadır. Adomako-Bonsu ve ark.²⁵, HepG2 hücrelerine 5 saat süreyle uygulanan RA’nın 700 µM’ye kadar toksik olmadığını ve 2800 µM konsantrayonda %25 toksisiteye neden olduğunu; Wu ve ark.²⁶, HepG2 hücrelerine 24 veya 48 saat süreyle uygulanan 160 µM RA’nın toksik olmadığını bildirmişlerdir. Ozgun ve Ozgun²⁷, HepG2 hücrelerine 24 saat süreyle uygulanan 100 µM RA’nın hücre canlılığında azalmaya yol açmazken, 1000 µM RA’nın ise hücre canlılığını %50’den fazla azalttığını bildirmişlerdir. Diğer yandan Ma ve ark.²⁸, HepG2 hücrelerine 24 saat süreyle uygulanan yaklaşık 35 µM RA’nın hücre canlılığını azalttığını bildirmişlerdir. Bu sebeple öncelikle çalışmamızda 500 µM’ye kadar RA konsantrasyonları HepG2 hücrelerine 24 saat boyunca uygulanarak RA’nın hücre canlılığı üzerine etkisi araştırıldı. 50, 100 ve 200 µM RA HepG2 hücrelerinde hücre canlılığını anlamlı olarak artırırken, 300 µM ve üzeri RA konsantrasyonları hücre canlılığını anlamlı olarak azalttı ve bu sebeple palmitat ile oluşturulan yağlanmaya karşı 200 µM’ye kadar RA konsantrasyonları uygulandı.

HepG2 hücrelerinde palmitat ile oluşturulan hücresel NAFLD modelinde hücre canlılığının azaldığı, hücre içi yağlanmanın ise arttığı bilinmektedir^7,8. Çalışmamızda da literatürle uyumlu olarak palmitat uygulaması hücre canlılığını anlamlı olarak azalttı ve hücre içi trigliserid düzeyini anlamlı olarak artırdı. Aynı zamanda palmitat uygulamasının hücre içi lipid içeriğini artırdığı mikroskopik olarak da görüldü. Bu bulgular, çalışmamızda HepG2 hücrelerinde palmitat ile hücresel NAFLD modelinin oluştuğunu kanıtlamaktadır.

Çalışmamızda 50, 100 ve 200 µM RA, palmitatın sebep olduğu hücre ölümünü anlamlı olarak azalttı. Literatürde palmitat ile oluşturulan hücresel NAFLD modelinde RA’nın hücre canlılığı üzerine etkisini araştıran bir çalışmaya rastlamadık, ancak bulgularımızı destekler nitelikte farklı bir deneysel modelde RA’nın HepG2 hücrelerinde doza bağlı olarak tert-butil hidroperoksit ile oluşturulan hücre ölümünü azalttığı bildirilmiştir²⁹. Çalışmamızda 50, 100 ve 200 µM RA, palmitatın sebep olduğu trigliserid düzeylerindeki artışı anlamlı olarak azalttı ve RA’nın yağlanmayı özellikle yüksek dozlarda azalttığı mikroskopik olarak Oil Red-O boyama ile de görüldü. Palmitat ile oluşturulan deneysel yağlanma üzerine RA’nın etkisini araştıran tek bir çalışmaya rastladık ve 2020 yılında yayınlanan bu çalışmada Kim ve ark.¹⁰, çalışmamızla uyumlu olarak, RA’nın 500 µM palmitat ile oluşturulan yağlanmayı azalttığını bildirmiştir.

Çalışmamızda HepG2 hücrelerinde 1 mM palmitat uygulaması PON1 ve PON3 protein düzeylerini anlamlı olarak değiştirmedi. Literatürde Özgün ve ark.⁸, çalışmamızı destekler nitelikte, 1 mM palmitat ile oluşturulan deneysel NAFLD modeli oluşturulan HepG2 hücrelerine palmitat uygulamasının PON1 ve PON3 protein düzeylerini değiştirmediğini bildirmişlerdir. Aynı zamanda, Kudchodkar ve ark.³⁰ diyetsel tripalmitinin sıçanlarda PON1 aktivitesini değiştirmediğini, Boshtam ve ark.³¹ ise HDL’nin palmitik asit içeriği ile PON1 aktiviteleri arasında fark olmadığını bildirmişlerdir.

Literatürde RA’nın PON1 veya PON3 enzimleri üzerine etkisini araştıran bir çalışma bulunmamaktadır. Çalışmamızda hücre canlılığı ve hücre içi yağlanma üzerine en etkili dozlar olan 100 ve 200 µM RA’nın hem direkt olarak HepG2 hücrelerinde hem de HepG2 hücrelerinde palmitat ile oluşturulan hücresel NAFLD modelinde PON1 ve PON3 protein ekspresyonları üzerine anlamlı etkisi yoktu. Bu bulgular ışığında RA’nın ne tek başına uygulandığında, ne de palmitat ile birlikte uygulandığında HepG2 hücrelerinde PON1 ve PON3 protein düzeyleri üzerine anlamlı etkisi olmadığını söyleyebiliriz.

Çalışmanın Kısıtlılıkları

İn vitro deneysel bir çalışma olması sebebiyle RA’nın etkilerinin sadece hücresel düzeyde incelenmesi, deneysel NAFLD modelinin hücrelerde serum açlığı yaratmamak için literatürde belirtildiği şekilde 24 saat ile sınırlı olması ve literatürde de sıklıkla kullanılmasına rağmen primer hepatositler yerine HepG2 hücre hattı kullanılması bu çalışmanın kısıtlılıklarıdır.

SONUÇ

Sonuç olarak çalışmamız, RA’nın insan kaynaklı hepatoma hücrelerinde palmitat ile oluşturulan hücresel NAFLD modelinde hücre canlılığını artırdığını, yağlanmayı azalttığını, ancak PON1 ve PON3 protein düzeylerini değiştirmediğini gösterdi. Bulgularımız ışığında, RA’nın, yağlanmayı azaltması sebebiyle NAFLD’nin önlenmesinde etkili olabileceğini, ancak antiaterojenik enzimler olan PON1 ve PON3 düzeyleri üzerine ise etkisinin olmadığını söyleyebiliriz. Bununla birlikte çalışmamız, in vitro deneysel bir çalışma olup, bulgularımızın gelecekteki deney hayvanı ve insan çalışmaları ile de desteklenmesi gereklidir.

Etik

Etik Kurul Onayı: Bu çalışma Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Dekanlığı Bilimsel Araştırmalar Etik Kurulu tarafından 29.03.2017 tarihinde TÜTF-BAEK 2017/95 protokol kodu ve 06/05 karar no ile onaylandı.

Hasta Onayı: Bu çalışmada ticari olarak satılan HepG2 hücreleri kullanılmıştır.

Hakem Değerlendirmesi: Editörler kurulu ve editörler kurulu dışında olan kişiler tarafından değerlendirilmiştir.

Yazarlık Katkıları

Cerrahi ve Medikal Uygulama: E.Y., E.Ö., Konsept: E.Y., E.Ö., Dizayn: E.Y., E.Ö., Veri Toplama veya İşleme: E.Y., E.Ö., Analiz veya Yorumlama: E.Y., E.Ö., Literatür Arama: E.Y., E.Ö., Yazan: E.Y., E.Ö.

Çıkar Çatışması: Yazarlar bu makale ile ilgili olarak herhangi bir çıkar çatışması bildirmemiştir.

Finansal Destek: Bu çalışma, Trakya Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi (TÜBAP) tarafından TÜBAP-2017/134 proje numarası ile desteklenmiş ve Trakya Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü’nde tamamlanmış, Esra YAKŞİ’nin yüksek lisans tezinden üretilmiştir. Bu çalışmaya ait veriler, 2019 yılında Bandırma/Türkiye’de düzenlenen Uluslararası Tıp ve Sağlık Bilimleri Araştırmaları Kongresi’nde sözlü sunum olarak sunulmuştur. TÜBAP’a ve kemilüminesans görüntülemelerin gerçekleştirildiği Trakya Üniversitesi Teknoloji Araştırma ve Geliştirme Uygulama ve Araştırma Merkezi’ne teşekkür ederiz.

References

Chalasani N, Younossi Z, Lavine JE, Diehl AM, Brunt EM, Cusi K, et al. The diagnosis and management of non-alcoholic fatty liver disease: practice Guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases, American College of Gastroenterology, and the American Gastroenterological Association. Hepatology. 2012;55:2005-23.

DeFilippis AP, Blaha MJ, Martin SS, Reed RM, Jones SR, Nasir K, et al. Nonalcoholic fatty liver disease and serum lipoproteins: the Multi-Ethnic Study of Atherosclerosis. Atherosclerosis. 2013;227:429-36.

Araya J, Rodrigo R, Videla LA, Thielemann L, Orellana M, Pettinelli P et al. Increase in long-chain polyunsaturated fatty acid n - 6/n - 3 ratio in relation to hepatic steatosis in patients with non-alcoholic fatty liver disease. Clin Sci (Lond). 2004;106:635-43.

Byrne CD, Targher G. NAFLD: a multisystem disease. J Hepatol. 2015;62(1 Suppl):47-64.

Sookoian S, Pirola CJ. Non-alcoholic fatty liver disease is strongly associated with carotid atherosclerosis: a systematic review. J Hepatol. 2008;49:600-7.

Précourt LP, Amre D, Denis MC, Lavoie JC, Delvin E, Seidman E, et al. The three-gene paraoxonase family: physiologic roles, actions and regulation. Atherosclerosis. 2011;214:20-36.

Gómez-Lechón MJ, Donato MT, Martínez-Romero A, Jiménez N, Castell JV, O’Connor JE. A human hepatocellular in vitro model to investigate steatosis. Chem Biol Interact. 2007;165:106-16.

Özgün GS, Özgün E, Tabakçıoğlu K, Gökmen SS, Eskiocak S. Effect of palmitate-induced steatosis on paraoxonase-1 and paraoxonase-3 enzymes in human-derived liver (HepG2) cells. Archives of Clinical and Experimental Medicine. 2019;4:118-21.

Jang E, Shin MH, Kim KS, Kim Y, Na YC, Woo HJ, et al. Anti-lipoapoptotic effect of Artemisia capillaris extract on free fatty acids-induced HepG2 cells. BMC Complement Altern Med. 2014;14:253.

Kim M, Yoo G, Randy A, Son YJ, Hong CR, Kim SM, et al. Lemon Balm and Its Constituent, Rosmarinic Acid, Alleviate Liver Damage in an Animal Model of Nonalcoholic Steatohepatitis. Nutrients. 2020;12:1166.

Bulgakov VP, Inyushkina YV, Fedoreyev SA. Rosmarinic acid and its derivatives: biotechnology and applications. Crit Rev Biotechnol. 2012;32:203-17.

Kim GD, Park YS, Jin YH, Park CS. Production and applications of rosmarinic acid and structurally related compounds. Appl Microbiol Biotechnol. 2015;99:2083-92.

Park JY, Kim Y, Im JA, Lee H. Oligonol suppresses lipid accumulation and improves insulin resistance in a palmitate-induced in HepG2 hepatocytes as a cellular steatosis model. BMC Complement Altern Med. 2015;15:185.

Xu S, Nam SM, Kim JH, Das R, Choi SK, Nguyen TT, et al. Palmitate induces ER calcium depletion and apoptosis in mouse podocytes subsequent to mitochondrial oxidative stress. Cell Death Dis. 2015;6:e1976.

Yang X, Chan C. Repression of PKR mediates palmitate-induced apoptosis in HepG2 cells through regulation of Bcl-2. Cell Res. 2009;19:469-86.

Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983;65:55-63.

Ahmadian S, Barar J, Saei AA, Fakhree MA, Omidi Y. Cellular toxicity of nanogenomedicine in MCF-7 cell line: MTT assay. J Vis Exp. 2009;(26):1191.

Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951;193:265-75.

Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227:680-5.

Schneider CA, Rasband WS, Eliceiri KW. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 2012;9:671-5.

Younossi ZM, Koenig AB, Abdelatif D, Fazel Y, Henry L, Wymer M. Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease-Meta-analytic assessment of prevalence, incidence, and outcomes. Hepatology. 2016;64:73-84.

Review Team, LaBrecque DR, Abbas Z, Anania F, Ferenci P, Khan AG, et al. World Gastroenterology Organisation global guidelines: Nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis. J Clin Gastroenterol. 2014;48:467-73.

Pérez-Fons L, Garzón MT, Micol V. Relationship between the antioxidant capacity and effect of rosemary (Rosmarinus officinalis L.) polyphenols on membrane phospholipid order. J Agric Food Chem. 2010;58:161-71.

Polimeni L, Del Ben M, Baratta F, Perri L, Albanese F, Pastori D, et al. Oxidative stress: New insights on the association of non-alcoholic fatty liver disease and atherosclerosis. World J Hepatol. 2015;7:1325-36.

Adomako-Bonsu AG, Chan SL, Pratten M, Fry JR. Antioxidant activity of rosmarinic acid and its principal metabolites in chemical and cellular systems: Importance of physico-chemical characteristics. Toxicol In Vitro. 2017;40:248-55.

Wu J, Zhu Y, Li F, Zhang G, Shi J, Ou R, et al. Spica prunellae and its marker compound rosmarinic acid induced the expression of efflux transporters through activation of Nrf2-mediated signaling pathway in HepG2 cells. J Ethnopharmacol. 2016;193:1-11.

Ozgun GS, Ozgun E. The cytotoxic concentration of rosmarinic acid increases MG132-induced cytotoxicity, proteasome inhibition, autophagy, cellular stresses, and apoptosis in HepG2 cells. Hum Exp Toxicol. 2020;39:514-23.

Ma ZJ, Yan H, Wang YJ, Yang Y, Li XB, Shi AC, et al. Proteomics analysis demonstrating rosmarinic acid suppresses cell growth by blocking the glycolytic pathway in human HepG2 cells. Biomed Pharmacother. 2018;105:334-49.

Lima CF, Fernandes-Ferreira M, Pereira-Wilson C. Phenolic compounds protect HepG2 cells from oxidative damage: relevance of glutathione levels. Life Sci. 2006;79:2056-68.

Kudchodkar BJ, Lacko AG, Dory L, Fungwe TV. Dietary fat modulates serum paraoxonase 1 activity in rats. J Nutr. 2000;130:2427-33.

Boshtam M, Razavi AE, Pourfarzam M, Ani M, Naderi GA, Basati G, et al. Serum paraoxonase 1 activity is associated with fatty acid composition of high density lipoprotein. Dis Markers. 2013;35:273-80.

Palmitat ile Non-alkolik Yağlı Karaciğer Hastalığı Modeli Oluşturulan HepG2 Hücrelerinde Rosmarinik Asitin Hücre Canlılığına, Yağlanmaya, Paraoksonaz-1 ve Paraoksonaz-3 Protein Düzeylerine Etkisi