ÖZET

Amaç:

Antifibrotik ve antitümör etkinliği gösterilmiş bir tirozin kinaz inhibitörü olan nintedanibin ciddi bir akciğer hastalığı olan akut akciğer hasarı (ALI) modelinde etkileri ve bu hastalığa karşı olası koruyucu etkinliğinin ortaya konulması ve NLRP3 / nükleer faktör kappa B (NF-κB) yolağı üzerine olası etkisinin incelenmesidir.

Gereç ve Yöntem:

Bu çalışmada 40 adet erkek Wistar albino sıçan kullanıldı. Bu sıçanlar eşit büyüklükte 5 gruba ayrıldı. Deney başlamadan önce, nintedanib seçilen gruplara 25 mg/kg, 50 mg/kg ve 100 mg/kg dozlarında oral olarak uygulandı. Nintedanib uygulamasından 24 saat, 12 saat veya 1 saat sonra, ALI için seçilen sıçanlara intratrakeal LPS uygulandı. İnterlökin (IL)-1β ve tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) miktarları ELISA yöntemiyle, NLRP3, kaspaz-1, IL-1β ve NF-kB gen ekspresyonları ise revers-transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu yöntemiyle ölçüldü.

Bulgular:

Nintedanib uygulamasının, LPS ile indüklenen ALI’li sıçanların dokularında yüksek NLRP3, kaspaz-1, IL-1β ve NF-κB ekspresyonlarını ve IL-1β ve TNF-α sitokin düzeylerini düşürdüğü gözlendi. 50 mg/kg nintedanib alan akciğer hasarı grubunda yer alan sıçanlardan elde edilen bulgular, sağlıklı kontrol grubuna en çok benzeyen bulgulardı.

Sonuç:

ALI ile modellenen sıçanlarda nintedanibin NLRP3/NF-κB sinyal yolunu modüle ettiği ve ALI’nin etkilerini azalttığı gösterilmiştir.

GİRİŞ

Akut akciğer hasarı (ALI), yüksek mortalite oranlarına sahip bir akciğer enflamasyonu türüdür ve alveoler kapiller bariyerin bozulması ve gaz değişimi disfonksiyonu ile karakterizedir^1,2. Ayrıca akciğer kompliyansında azalma, kalıcı hipoksemi ve solunum yetmezliği ile karakterizedir. ALI olguları yoğun bakım ünitelerinde yaygın olarak görülmektedir. Çeşitli faktörler ALI’ye neden olabilir, ancak en yaygın nedenler sepsis, pnömoni, dissemine intravasküler koagülasyon, yanıklar, akut pankreatit, masif kan transfüzyonları, mide içeriğinin aspirasyonu, şok, acil kan transfüzyonları ve travmadır³. Bu akut ve şiddetli hastalığın patogenezi belirsizdir. Mevcut fikir birliği, ALI’nin enflamatuvar bir süreç nedeniyle kontrolsüz sitokin üretiminin neden olduğu hasarın bir sonucu olarak ortaya çıktığını göstermektedir⁴. ALI’nin spesifik bir tedavisi yoktur. Bu nedenle, ALI ile ilişkili morbidite ve mortalite oranlarını azaltmak için yeni stratejilere, biyobelirteçlere ve tedavilere ihtiyaç vardır⁵.

Önceki çalışmalar, ALI tedavisinde farklı mekanik ventilasyon tekniklerinin ve farklı farmakolojik ajanların kullanımını incelemiştir^6-8. Ancak, çok sayıda çalışmaya rağmen henüz tatmin edici sonuçlar elde edilememiştir. Tirozin kinazlar ve ilgili yolakları daha yakın zamanda keşfedilmiş ve tirozin kinazların ve ilgili yolaklarının birçok hastalığın fizyopatolojisinde rol oynayabileceği gösterilmiştir. Buna bağlı olarak, terapötik yaklaşımlar için yeni hedefler haline gelmişlerdir.

Tirozin kinaz, hücre içi sinyal iletiminde önemli rol oynayan ve protein fosforilasyonunu katalize eden bir enzimdir. Tirozin kinazlar, amino asit kalıntılarının fosforilasyonu yoluyla hayatta kalma ve diğer çeşitli hücresel işlevler için çok sayıda sinyal yolunu modüle eder. Öte yandan, tirozin kinaz inhibitörleri de ATP ve substratının bağlanmasına müdahale ederek fosforilasyonu önler^9,10.

Çeşitli tirozin kinazlar ve inhibitörleri bu etkilerle ilişkilidir. Dahası, zaman geçtikçe yeni tirozin kinazlar ve inhibitörleri keşfedilmeye devam etmektedir. Farklı tirozin kinaz inhibitörleri, inhibe ettikleri reseptörler ve farklı yolaklar üzerindeki etki mekanizmaları ile karakterize edilir. HER ailesinin inhibitörleri (EGFR-1 ve EGFR-2) ve birinci nesil ve ikinci nesil çok hedefli tirozin kinaz inhibitörleri (VEGFR ve PDGFR) bu bileşiklerin bazı örnekleridir¹¹.

Bu inhibitörler arasında, son zamanlarda enflamasyon ve ilgili hastalıklarda deneysel olarak araştırılmaya başlanan ve pulmoner hipertansiyon tedavisi için ruhsat almış olan nintedanib, bu çalışmanın konusunu oluşturmaktadır. Daha önce nintedanibin mezenkimal belirteçlerin ekspresyonunu azalttığı, fosforilasyonu inhibe ettiği ve hemodinamiği iyileştirdiği bulunmuştur¹².

Nintedanib, hem reseptör (FGFR-1, VEGFR-2 ve PDGFR) hem de reseptör olmayan (Src, Lyn ve Lck) tirozin kinazları inhibe eden çok hedefli birinci nesil tirozin kinaz inhibitörü olarak tasarlanmış bir moleküldür¹³. Nintedanibin yumurtalık kanseri, kolorektal kanser ve küçük hücreli dışı akciğer kanseri dahil olmak üzere çeşitli kanser türlerine karşı etkinliğine ilişkin çalışmalar devam etmektedir. Önceki çalışmalar incelendiğinde nintedanibin PDGFR üzerinden etkileri nedeniyle idiyopatik pulmoner fibrozis tedavisinde kullanıldığı görülmektedir¹⁴. Ayrıca bu ilacın in vitro olarak prostat kanseri hücrelerinde VEGF reseptör ekspresyonunu ve anjiyogenezi inhibe ettiği ve mikrodamar yoğunluğunu azalttığı gösterilmiştir¹⁵. VEGF-C/VEGFR-3 sinyalizasyonunun makrofajlarda deneysel akciğer hasarının etkilerini iyileştirdiği gösterilmiştir, bu da bu mekanizmanın ALI ve akut solunum sıkıntısı sendromu (ARDS) tedavisinde de rol oynayabileceğini düşündürmektedir¹⁶.

NLRP3, NLR ailesine ait bir inflamazomdur. İnflamazomlar doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli işlevsel üyeleridir ve en karakteristik inflamazom NLRP3’tür. Enflamasyonla ilişkili ana inflamazom olarak bilinir ve ALI olgularında önemli bir rol oynar¹⁷.

Önceki çalışmalarda nintedanib ve NLRP3 arasındaki ilişkiyi araştırmıştır. Literatürde nintedanib tedavisinin enflamatuvar hücre sayısını azaltarak poliheksametilen guanidinin (PHMG) neden olduğu akciğer hasarını etkili bir şekilde hafiflettiği gösterilmiştir. Ayrıca nintedanibin akciğer dokularında enflamatuvar sitokinlerin ve fibrotik faktörlerin ekspresyonunu ve NLRP3 aktivasyonunu önemli ölçüde azalttığı belirlenmiştir. Bu sonuçlar nintedanibin PHMG uygulanan farelerin akciğerlerinde enflamatuvar yanıtı azaltabileceğini ve pulmoner fibrozisi iyileştirebileceğini düşündürmektedir¹⁸.

ALI kaynaklı mortalitenin epitelyal bariyer fonksiyonunun kaybı ile ilişkili olduğu bilinmektedir¹⁹. NLRP3’ün tübüler epitel hücrelerinde TGF-β sinyalizasyonunda düzenleyici bir rolü olduğu gösterilmiş ve ayrıca IL-1β ve IL-18 olgunlaşmasını ve piroptoz indüksiyonunu etkilemenin yanı sıra, NLRP3’ün bağışıklık ve doku hasarını da etkilediği gözlemlenmiştir²⁰.

Bu önceki bulgular ışığında, nintedanibin NLRP3/NF-κB sinyal yolağını modüle ederek ALI’yi hafifletmesi mümkündür. Bu nedenle, bu çalışmanın amacı, antifibrotik ve antitümör etkinliğe sahip olduğu gösterilen bir tirozin kinaz inhibitörü olan nintedanibin etkilerini bir ALI modelinde incelemek ve bu hastalığa karşı olası koruyucu etkinliğini ve olası etkinliğinin NLRP3 ve NF-κB yolakları ile bağlantısını göstermektir.

GEREÇ VE YÖNTEM

1. Deney Hayvanları

Bu çalışmada 240-280 g ağırlığında 40 adet Wistar albino erkek sıçan kullanıldı. Tüm sıçanlar Atatürk Üniversitesi Tıbbi Deneysel Uygulama ve Araştırma Merkezi Deney Hayvanları Laboratuvarı’ndan temin edildi. Tüm tedaviler ve prosedürler yerel etik kurul tarafından kabul edilen ulusal kılavuzlara göre gerçekleştirildi. Çalışma, Atatürk Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu tarafından onaylandı (tarih: 26.04.2022, no: E-42190979-000-2200127868). Sıçanlar standart polipropilen kafeslerde, kontrollü sıcaklık (22±1 °C) ve nem (%50-60) ve 12 saatlik aydınlık/karanlık fotoperiyodu olan bir ortamda barındırıldı. Standart gıda ve musluk suyu ad libitum olarak sağlandı.

2. Kimyasallar

Bu çalışmada Nintedanib (Ofev, Boehringer Ingelheim, Almanya), LPS (E. coli 055:B5, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Almanya), ketamin (Ketalar 500 mg/10 mL, Pfizer, Türkiye) ve ksilazin (Basilazine %2, Biotek, Türkiye) kullanıldı.

3. Deney Grupları

Sıçanlar, her grupta 8 sıçan olacak şekilde rastgele 5 gruba ayrıldı:

Grup 1: Sağlıklı kontrol grubu,

Grup 2: ALI grubu (5 mg/kg LPS),

Grup 3: ALI (5 mg/kg LPS) + 25 mg/kg nintedanib (NDN),

Grup 4: ALI (5 mg/kg LPS) + 50 mg/kg NDN,

Grup 5: ALI (5 mg/kg LPS) + 100 mg/kg NDN.

4. Deneysel Tasarım ve Kullanılan İlaçların Hazırlanması

Bu çalışmada kullanılan 40 erkek Wistar albino sıçan rastgele eşit büyüklükte 5 gruba ayrılmıştır. Nintedanib seçilen gruplara 25 mg/kg, 50 mg/kg ve 100 mg/kg dozlarında oral gavaj yoluyla uygulandı. Nintedanib uygulamasından 24 saat, 12 saat veya 1 saat sonra, seçilen sıçanlara LPS uygulandı. Bu 3 dozaj seçilirken nintedanibin yarılanma ömrü göz önünde bulunduruldu^21,22.

Son doz verildikten 1 saat sonra sıçanlar ketamin (90 mg/kg) ve ksilazin (10 mg/kg) ile anestezi altına alındı²³. Sterilizasyonun ardından cerrahi neşter kullanılarak orta hat boyun insizyonu yapıldı. Kesi yapıldıktan sonra, 5 mg/kg LPS²⁴(Sigma-Aldrich) 0,2 mL %0,09 NaCl içinde çözüldü ve sağlıklı kontrol grubu hariç tüm gruplara intratrakeal olarak uygulandı. Akciğerlerin homojen infiltrasyonunu sağlamak için sıçanlar 3 eksende tekrar tekrar döndürüldü. Daha sonra insizyon cerrahi olarak dikildi ve sodyum fusidat (%2) topikal olarak uygulandı²⁵. Sıçanlar 24 saat sonra 50 mg/kg gibi yüksek bir dozda tiyopental ile ötenazi edildi ve ardından kan ve akciğer dokusu örnekleri toplandı.

5. Moleküler Testler

Bu çalışma in vivo olarak gerçekleştirildi. Çalışma kapsamında gen ekspresyonları moleküler olarak incelendi. Akciğer NLRP3, kaspaz-1, NF-κB ve IL-1β mRNA ekspresyonlarını incelemek için revers-transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) kullanıldı (Tablo 1). Bu amaçla, akciğer doku örnekleri homojenize edildi. RNA’ları izole edildi, cDNA’ları sentezlendi ve mRNA ekspresyonları kantitatif olarak incelendi.

6. RT-PCR

6.1. Akciğer Dokularından RNA Ekstraksiyonu

Akciğer örnekleri ayrı ayrı tartıldı ve RNAlater RNA Stabilizasyon Reaktifi (QIAGEN, Almanya) ile 4 haftaya kadar
4 °C’de saklandı. Dokular TissueLyser II (QIAGEN) ile homojenize edildi ve RNA ekstraksiyonu QIAcube RNA izolasyon cihazında (QIAGEN) gerçekleştirildi. Toplam mRNA 260 nm’de nanodrop spektrofotometrisi (EPOCH, Biotek) ile ölçüldü.

6.2. RNA’dan cDNA Elde Etme

cDNA sentezi, bir cDNA ters transkripsiyon kiti kullanılarak toplam RNA’dan gerçekleştirildi. Her reaksiyon kitin talimatlarında belirtilen RNA miktarı ile gerçekleştirildi. Elde edilen cDNA miktarı nanodrop spektrofotometresi (EPOCH Plate, Biotek) ile ölçüldü ve cDNA -20 °C’de saklandı.

6.3. Gerçek Zamanlı PCR ile mRNA İfadelerinin Kantitatif İncelenmesi

Akciğer mRNA ekspresyonları SYBR GREEN Gen İfadesi Master Karışım Kiti kullanılarak incelendi. Referans gen olarak GAPDH kullanıldı. Önerilen döngülerde gerçekleştirilen amplifikasyon ve kantifikasyon işlemleri için önerilen miktarda cDNA pipetlendi.

6.4. Enzim Bağlantılı İmmünosorbent Testi (ELISA)

80 °C’de saklanan akciğer örnekleri TissueLyser II cihazı (QIAGEN) kullanılarak sıvı nitrojen içinde fiziksel homojenizasyona tabi tutuldu. Her örnek 100 mg olacak şekilde tartıldı. Tartılan dokular daha sonra TissueLyser II cihazı kullanılarak bir Eppendorf tüpünde 1 mL PBS homojenat tamponu içinde homojenize edildi. Daha sonra, dokular kitlerin üreticisi tarafından önerildiği şekilde ELISA için santrifüjlendi. Elde edilen süpernatantların interlökin (IL)-1β ve tümör nekroz faktörü-α (TNF-α) sitokin seviyeleri ölçüldü.

IL-1β ölçümleri için sıçan IL-1β ELISA kiti (Kat. No. E0119RA-96T, BTLAB, UK), TNF-α ölçümleri için ise sıçan TNF-α ELISA kiti (Kat. No. E0764RA-96T) kullanıldı. Protein miktarları Lowry yöntemi kullanılarak ölçüldü ve elde edilen veriler hücre protein konsantrasyonlarına göre normalize edildi.

7. Histopatolojik Yöntem

Nekropsi ile elde edilen akciğer dokuları %3,7’lik nötral formalin solüsyonuna yerleştirildi. Dokulara rutin alkol-ksilol takip işlemleri uygulandı ve ardından dokular parafin bloklara gömüldü. 5 µm kalınlığındaki kesitler poly-L-lysine lamlara aktarılmış ve Masson’s trichrome ile boyandı. Akciğer dokularında gözlenen perivasküler ödem, submukozal ödem, alveolar septal kalınlaşma ve enflamasyon gibi histopatolojik bulgular, sağlıklı kontrol grubuna kıyasla yok (0), hafif (1), orta (2) veya şiddetli (3) olarak yarı kantitatif olarak puanlandı.

İstatistiksel Analiz

Ct değerleri cihaz ile otomatik olarak ΔCt değerlerine dönüştürüldü ve elde edilen sonuçlar IBM Statistical Package for the Social Sciences statistics 25.0 (IBM Corp., ABD) ile istatistiksel olarak değerlendirildi. Homojen olmayan varyansa sahip veriler tek yönlü ANOVA ve post-hoc çoklu karşılaştırma testi olarak Games-Howell testine tabi tutuldu. Homojen varyansa sahip veriler tek yönlü ANOVA ve post-hoc çoklu karşılaştırma testi olarak Tukey testine tabi tutuldu. P<0,05 değerleri anlamlı kabul edildi.

BULGULAR

1. Moleküler Bulgular

1.1. Akciğer Dokularında Kaspaz-1 Ekspresyonu

Grupların kaspaz-1 ekspresyonları incelendiğinde, sağlıklı kontrol grubunun en düşük kaspaz-1 ekspresyon seviyelerine sahip olduğu belirlendi. ALI grubunun sağlıklı kontrol grubuna kıyasla çok anlamlı derecede daha yüksek kaspaz-1 ekspresyon seviyelerine sahip olduğu da gözlendi (p<0,001). ALI + NDN gruplarının kaspaz-1 ekspresyonları incelendiğinde, nintedanibin her 3 dozunu da alan grupların ALI grubuna kıyasla çok anlamlı derecede düşük kaspaz-1 ekspresyonlarına sahip olduğu, en düşük kaspaz-1 ekspresyonunun ALI + 50 NDN grubunda olduğu görüldü (p<0,001).

1.2. Akciğer Dokularında IL-1β Ekspresyonu

Grupların IL-1β ekspresyonları incelendiğinde, sağlıklı kontrol grubunun en düşük IL-1β ekspresyon seviyelerine sahip olduğu belirlendi. Ayrıca, ALI grubunun sağlıklı kontrol grubuna kıyasla çok anlamlı derecede daha yüksek IL-1β ekspresyon seviyelerine sahip olduğu gözlendi (p<0,001). ALI + NDN gruplarının IL-1β ekspresyonları incelendiğinde, nintedanibin her 3 dozunu da alan grupların ALI grubuna kıyasla çok anlamlı derecede düşük IL-1β ekspresyonlarına sahip olduğu, en düşük IL-1β ekspresyonunun ALI + 50 NDN grubunda olduğu görüldü (p<0,001) (Şekil 1).

1.3. Akciğer Dokularında NF-κB Ekspresyonu

Grupların NF-κB ekspresyonları incelendiğinde, sağlıklı kontrol grubunun en düşük NF-κB ekspresyonuna sahip olduğu belirlendi. ALI grubunun sağlıklı kontrol grubuna kıyasla çok anlamlı derecede daha yüksek NF-κB ekspresyon seviyelerine sahip olduğu da gözlendi (p<0,001). ALI + NDN gruplarının NF-κB ekspresyonları incelendiğinde, nintedanibin her 3 dozunu da alan grupların ALI grubuna kıyasla çok önemli ölçüde daha düşük NF-κB ekspresyonlarına sahip olduğu, en düşük NF-κB ekspresyonunun ALI + 50 NDN grubunda olduğu görüldü (p<0,001) (Şekil 1.

1.4. Akciğer Dokularında NLRP3 Ekspresyonu

Grupların NLRP3 ekspresyonları incelendiğinde, sağlıklı kontrol grubunun en düşük NLRP3 ekspresyon seviyelerine sahip olduğu belirlendi. Ayrıca ALI grubunun sağlıklı kontrol grubuna kıyasla çok anlamlı düzeyde daha yüksek NLRP3 ekspresyonuna sahip olduğu gözlendi (p<0,001). ALI + NDN gruplarının NLRP3 ekspresyonları incelendiğinde, nintedanibin her 3 dozunu da alan grupların ALI grubuna kıyasla çok anlamlı derecede düşük NLRP3 ekspresyonuna sahip olduğu, en düşük NLRP3 ekspresyonunun ALI + 50 NDN grubunda olduğu tespit edildi (p<0,001) (Şekil 1).

2. ELISA Bulguları

2.1. Nintedanibin Akciğer Dokularında TNF-α Sitokin Düzeyleri Üzerine Etkisi

Grupların TNF-α seviyeleri incelendiğinde, sağlıklı kontrol grubunun en düşük TNF-α seviyelerine sahip olduğu belirlendi. Ayrıca, ALI grubunun sağlıklı kontrol grubuna kıyasla çok anlamlı derecede daha yüksek TNF-α seviyelerine sahip olduğu gözlendi (p<0,001). ALI + NDN gruplarının TNF-α seviyeleri ALI grubuna kıyasla çok anlamlı derecede düşüktü. ALI + NDN grupları arasında, ALI + 50 NDN grubunun TNF-α seviyelerinin sağlıklı kontrol grubununkilere en çok benzediği bulundu (Şekil 2.

2.2. Nintedanibin Akciğer Dokularında IL-1β Sitokin Düzeyleri Üzerindeki Etkisi

Grupların IL-1β seviyeleri incelendiğinde, sağlıklı kontrol grubunun en düşük IL-1β seviyelerine sahip olduğu belirlendi. Ayrıca, ALI grubunun sağlıklı kontrol grubuna kıyasla çok anlamlı derecede daha yüksek IL-1β seviyelerine sahip olduğu gözlendi (p<0,001). ALI + NDN gruplarının IL-1β düzeyleri incelendiğinde, nintedanibin her 3 dozunu da alan grupların ALI grubuna kıyasla çok anlamlı derecede düşük IL-1β düzeylerine sahip olduğu, en düşük IL-1β düzeylerinin ALI + 25 NDN ve ALI + 50 NDN gruplarında olduğu görüldü (p<0,001). ALI + NDN grupları arasında, ALI + 50 NDN grubunun IL-1β seviyeleri sağlıklı kontrol grubununkilere en çok benzeyen seviyelerdi (Şekil 3).

3. Histopatolojik Bulgular

Sağlıklı kontrol grubunun histopatolojik incelemesinde, akciğer dokularındaki bronşlar, terminal bronşiyoller, respiratuvar bronşiyoller, alveolar keseler, alveolar duvarlar, arterler, venler ve kapiller damar yapıları ayrıntılı olarak incelendi. Herhangi bir patolojik bulguya rastlanmadı (Şekil 4A, 4B).

ALI grubunda vasküler adventisyada ileri derecede ödem alanları ve çok sayıda enflamatuvar hücre (görüntülerde daireler) bulundu. Akciğerlerin solunum parankimini kapsayan alveolar ağacın alveolar duvarlarında ileri ödem nedeniyle alveolar septal kalınlaşma (yıldızlar) gözlendi. Bu dokuda alveolleri yer yer infiltre eden eritrosit kümeleri bir diğer önemli bulguydu (Şekil 4C).

ALI grubuna benzer şekilde, ALI + 25 NDN grubunda da ödem ve enflamatuvar hücrelere bağlı submukozal kalınlaşma gözlenmiştir. Ancak gözlenen bulgular ALI + 25 NDN grubunda ALI grubuna kıyasla o kadar şiddetli değildi (Şekil 4D). ALI + 25 NDN grubunda gözlenen alveolar septal kalınlaşma da ALI grubuna kıyasla şiddetli değildi (Şekil 4D).

ALI + 50 NDN grubunda damarları çevreleyen submukoza ve terminal bronşiyollerin etrafındaki ödemli alanların belirgin şekilde iyileştiği gözlendi. ALI + 50 NDN grubundaki alveolar septal kalınlaşma sağlıklı kabul edilebilecek kadar önemsizdi. Bu dokularda enflamatuvar hücreler de nadiren gözlendi. Genel olarak, bu grubun sağlıklı kontrol grubuna benzer bir histolojik görünüme sahip olduğu gözlendi (Şekil 4E).

ALI + 100 NDN grubunda da damarların etrafında submukozal ödemli alanlar gözlendi. Ancak bu grupta gözlenen bulgular ALI grubundaki kadar şiddetli değildi. Ayrıca bu grupta hafif alveolar septal kalınlaşma gözlendi (Şekil 4F).

TARTIŞMA

Bu çalışmada, nintedanibin NLRP3/NF-κB aracılığıyla LPS ile indüklenen ALI üzerindeki etkileri incelenmiştir. IL-1β, kaspaz-1, NLRP3 ve NF-κB’nin yüksek ekspresyonlarının ve LPS uygulamasına bağlı olarak artan IL-1β ve TNF-α sitokin seviyelerinin, nintedanibin seçilen 3 dozunun da uygulanmasıyla azaldığı gözlenmiştir. Nintedanibin 50 mg dozunda uygulanması özellikle enflamasyonu ve pulmoner ödemi iyileştirmiş ve nihayetinde ALI’yi hafifleterek neredeyse sağlıklı kontrol dokularında görülenle aynı duruma ulaşmıştır.

LPS bir glikolipiddir ve Gram-negatif bakterilerin dış membranlarında bulunan LPS, özellikle serumda bulunan spesifik bir lipopolisakkarit bağlayıcı proteine (LBP) bağlanır²⁶. LBP’ye bağlanan LPS, bağışıklık hücrelerindeki CD14/TLR-4 reseptör kompleksini aktive ederek enflamatuvar mediatörlerin üretimini tetikler. Gram-negatif bakteriyel sepsisin önemli bir aracı olan LPS, insanlarda ve hayvanlarda Gram-negatif bakteriyel enfeksiyonların etkilerini incelemek için çok kullanışlı bir araç oluşturmaktadır. Bu yaklaşım, bakteriyel enfeksiyon durumlarında ortaya çıkan enflamatuvar yanıtların etkilerinin incelenmesine olanak sağlamaktadır²⁷. LPS ayrıca immün yanıtların neden olduğu ALI’yi incelemek için en uygun modellerden biridir²⁸. Akciğer, vasküler ve hava yolu yapıları olmak üzere iki temel anatomik yapıdan oluşur. Akciğer epiteli, akciğeri özellikle zararlı toksinlerden korur. Hem hava yolu hem de vasküler yapıları örten epitel dokular ALI’de önemli rol oynar²⁹. NF-κB yolağının aktivasyonu ve hava yolu epitelinin enflamasyonu, akciğer hasarına verilen en önemli lokal ve sistemik yanıtlardır³⁰. Mitojenle aktive olan protein kinaz (MAPK), LPS ile indüklenen NF-κB aktivasyonunu düzenler³¹ve NF-κB stimülasyonu çok sayıda hücre içi sinyal yolağını aktive eder^32,33. NF-κB ayrıca enflamasyonun ana düzenleyicisi olarak bilinen NLRP3’ü de aktive eder. NF-κB, pro-IL-1β’yı doğrudan aktif IL-1β’ya dönüştürerek ve NLRP3’ü prokaspaz-1’i aktif kaspaz-1’e dönüştürmek üzere aktive ederek enflamatuvar yanıtı düzenler³⁴. PDGFRβ/Akt/NF-κB/NLRP3 yolağının inhibisyonu ve NF-κB aktivitesinin modülasyonunun ALI’yi hafifletmek için etkili mekanizmalar olduğu gösterilmiştir^35,36. NLRP3 temel olarak iki şekilde aktive olur. Birinci tür aktivasyon, yukarıda belirtildiği gibi, NF-κB ve IL-1β aracılığıyla gerçekleşir. İkinci tip aktivasyon ise doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinde bulunan ve çeşitli patojenlerle ilişkili moleküler kalıplar (PAMP’lar) veya hasarla ilişkili moleküler kalıplar (DAMP’lar) tarafından aktive edilebilen önemli sinyal reseptörleri aracılığıyla gerçekleşir³⁷. NLRP3, ASC aracılığıyla pro-kaspaz-1 ile bir kompleks oluşturarak enflamasyona neden olan birincil proteindir. NLRP3 inflamazomunun aktivasyonu prokaspaz-1’in kaspaz-1’e dönüşmesine yol açar. Bu dönüşüm de olgun IL-1β ve IL-18’in üretimini ve salgılanmasını tetikler³⁸. IL-1β, IL-18 ve TNF-α, PRR aktivasyonuna yanıt olarak makrofajlar tarafından üretilen önemli proenflamatuvar sitokinlerdir. TNF üretimi esas olarak transkripsiyon düzeyinde düzenlenir. NLRP3’ün ALI’ye neden olan Staphylococcus aureus³⁹, Pseudomonas aeruginosa⁴⁰, Mycobacterium tuberculosis⁴¹ve influenza A virüsü⁴² gibi enfeksiyöz ajanların fizyopatolojisinde de önemli rol oynadığı gösterilmiştir.

Daha önce yapılan bir çalışmada, LPS’ye bağlı olarak artan NF-κB ve NLRP3 transkripsiyonunun çeşitli tedavi yöntemleriyle azaltılmasının, proenflamatuvar TNF-α ve IL-1β sitokinlerinin miktarlarını azaltarak akciğer hasarını hafifletmede etkili olduğu bulunmuştur⁴³. Önceki çalışmalar da NLRP3’ün ALI’de önemli rol oynadığını ve NLRP3 antagonistleri ile deneysel tedavinin ALI’ye karşı çok önemli faydalar sağladığını göstermiştir^17,44.

Bu çalışmalara benzer şekilde, bu çalışmanın bulguları NLRP3/NF-κB sinyal yolağının LPS uygulamasına bağlı olarak aktive olduğunu ortaya koymuştur. Yüksek NLRP3, NF-κB, kaspaz-1 ve IL-1β gen ekspresyonları ile TNF-α ve IL-1β sitokin düzeylerinin nintedanib tedavisi ile hafiflediği bulunmuştur. Bu bulgular, LPS uygulamasını takiben artan reseptör aktivasyonu nedeniyle enflamatuvar kaskadın indüklendiğini ve NLRP3’ün NF-κB sinyal yolağını aktive etmesi sonucu artan sitokin salınımı nedeniyle akciğer hasarının meydana geldiğini düşündürmektedir⁴⁵. Dahası, nintedanib alan gruplarda bu enflamatuvar kaskadın oldukça etkili bir şekilde bloke edildiği gözlemlenmiştir. Daha önceki klinik çalışmalarda, ALI hastalarının alveolar makrofajları tarafından yüksek düzeyde IL-1 ve IL-18 üretildiği tespit edilmiş ve IL-1 ve IL-18 üretimindeki bu artışın mortalite ve morbidite ile doğrudan ilişkili olduğu gösterilmiştir^46,47. IL-1 ve IL-18 sitokinlerinin NLRP3 yolağı ile doğrudan ilişkili olduğu bilinmektedir. Bu bağlamda, ALI ile ilgili önceki deneysel çalışmalarda IL-1 ve IL-18 sitokinlerinin antagonize edilmesiyle çok olumlu sonuçlar elde edilmiştir^48,49.

Nintedanib birinci nesil çok hedefli bir tirozin kinaz inhibitörüdür. Akciğer fonksiyonlarındaki bozulmayı azalttığı ve vasküler hücrelerin çoğalmasını engellediği için idiyopatik pulmoner fibrozis tedavisinde kullanılır⁵⁰. İdiyopatik pulmoner fibrozise ek olarak, fibrozan interstisyel akciğer hastalıkları olgularında kullanım için onaylanmıştır. Nintedanib böylece dünya çapında meydana gelen yaygın sağlık sorunlarına karşı uygulanabilir ve kullanımı ilgi odağı haline gelmiştir. Nintedanibin PDGF ve FGF reseptörlerinin fosforilasyonunu bloke ederek pulmoner arterlerdeki neointimal lezyonları ve medial duvar kalınlaşmasını iyileştirmesi nedeniyle pulmoner arteriyel hipertansiyon tedavisinde de kullanılabileceği gösterilmiştir¹². Nintedanib hem reseptör hem de reseptör olmayan tirozin kinazları inhibe eder. Önceki çalışmalar Src tirozin kinaz inhibisyonunun ALI’yi hafiflettiğini göstermiştir⁵¹. Reseptörleri tirozin kinaz inhibitörleri tarafından hedeflenen bir büyüme faktörü olan PDGF, pulmoner fibroz, ALI ve ARDS gibi akciğer hastalıklarının patogenezinde önemli bir rol oynar. Enflamasyon sırasında monositler ve granülositler için kemotaktik bir faktördür ve PDGF’nin aşırı ekspresyonu enflamatuvar hasarı indükleyebilir⁵². PDGFR’ye ek olarak, su ve proteinlere karşı vasküler geçirgenliği doğrudan düzenleyerek birçok organda önemli roller oynayan VEGF’nin reseptörleri de nintedanib tarafından hedeflenmektedir. VEGF, mRNA ekspresyonunu artırır, enflamasyonu aktive eder ve ALI olgularında kapiller sızıntıya ve pulmoner ödeme neden olur⁵³. Ayrıca, VEGF inhibisyonunun ALI’ye bağlı pulmoner ödemi azalttığı gösterilmiştir⁵⁴. Daha önce yapılan bir çalışma, nintedanibin prostat kanseri hücrelerinde artan VEGF reseptörlerini azaltarak anjiyogenezi inhibe ettiğini ortaya koymuştur. Aynı çalışmada nintedanib uygulaması sonucunda mikrovasküler yoğunluğun azaldığı da gözlemlenmiştir¹⁵. Bu çalışmanın sonuçları göz önünde bulundurulduğunda, nintedanibin hem büyüme faktörleri aracılığıyla hem de doğrudan doğuştan gelen bağışıklık sistemi yoluyla enflamasyonu baskıladığı ve ALI’yi hafiflettiği söylenebilir.

Nintedanibin bu çalışmada gözlemlenen olası etkileri NLRP3 üzerindeki doğrudan etkileriyle de açıklanabilir. Esas olarak idiyopatik pulmoner fibrozis tedavisinde kullanılan nintedanib, çeşitli sinyal yolakları üzerindeki etkileri nedeniyle literatürde birçok çalışmanın odağı olmuştur. Ancak bugüne kadar sadece bir çalışmada nintedanib ve NLRP3 arasındaki ilişki incelenmiştir. Bu çalışmada, nintedanibin akciğerlerdeki NLRP3 enflamatuvar yanıtının aktivasyonunu azaltarak ve pulmoner fibrozu iyileştirerek akciğer fibrozunu hafifletebildiği ve ayrıca nintedanibin IL-1 ve TNF-α seviyelerini azalttığı gösterilmiştir¹⁸. Nintedanibin anti-enflamatuvar etkilerinin incelendiği bir başka çalışmada, IL-1 düzeylerini azalttığı bulunmuştur⁵⁵. Bu çalışmada nintedanibin ALI’de NLRP3 üzerindeki etkileri literatürde ilk kez aydınlatılmıştır.

Bu çalışma aynı zamanda akciğer dokularındaki iyileşmeyi histopatolojik olarak da göstermiştir. ALI grubunun histopatolojik bulguları incelendiğinde, yaygın perivasküler ve submukozal ödem olduğu gözlenmiştir. Aynı zamanda alveolar septal kalınlaşma ve şiddetli enflamasyon tespit edildi. Nintedanibin her üç dozunun da verildiği gruplarda bu bulguların şiddetinin azaldığı ve ALI’nin hafiflediği gözlendi. ALI + 50 NDN grubunda ise bu bulguların çok hafif ve sağlıklı gruba yakın olduğu tespit edilmiştir.

Çalışma Kısıtlılıkları

Çalışmamızın kısıtlılığı, spesifik proteinlerin tanımlanmasında kullanılan Western blot analizinin akciğer dokusunda yapılamamış olmasıdır.

SONUÇ

Bu çalışma için tasarlanan ALI modeli aracılığıyla, ilk kez nintedanibin, NLRP3/NF-kB sinyal yolu yoluyla LPS kaynaklı ALI’yi azalttığı gösterilmiştir. Nintedanibin, LPS kaynaklı ALI olgularında NLRP3, IL-1β, kaspaz-1 ve NF-κB gen ekspresyonlarını ve IL-1β ve TNF-α sitokin düzeylerini azalttığı moleküler, biyokimyasal ve histopatolojik olarak doğrulandı. Bu sonuçlar, nintedanibin ALI’ye karşı koruma sağlayarak faydalı sonuçlar sağlama olasılığını desteklemekte ve bu ilacın kullanımının etkili olabileceğini düşündürmektedir.

Teşekkür

Bu çalışma Gülçin Tanrıverdiyeva’nın yüksek lisans tezinin bir parçasıdır.

Etik

Etik Kurul Onayı: Çalışma, Atatürk Üniversitesi Hayvan Deneyleri Yerel Etik Kurulu tarafından onaylandı (tarih: 26.04.2022, no: E-42190979-000-2200127868).

Hasta Onayı: Hayvanlar üzerinde yapılmıştır.

Yazarlık Katkıları

Cerrahi ve Medikal Uygulama: Z.H., G.T., P.A., E.T., E.Ç., Konsept: Z.H., G.T., Dizayn: Z.H., G.T., Veri Toplama veya İşleme: P.A., E.T., E.Ç., Analiz veya Yorumlama: P.A., E.T., E.Ç., Literatür Arama: Z.H., G.T., Yazan: Z.H., G.T.

Çıkar Çatışması: Yazarlar bu makale ile ilgili olarak herhangi bir çıkar çatışması bildirmemiştir.

Finansal Destek: Araştırmanın maddi desteği Atatürk Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinatörlüğü tarafından sağlanmıştır (TYL-2023-11601).

References

Zhang Z, Wang X, Ma C, Li Z, Chen H, Zhang Z, et al. Genipin protects rats against lipopolysaccharide-induced acute lung injury by reinforcing autophagy. Int Immunopharmacol. 2019;72:21-30.

Wu P, Yan H, Qi J, Jia W, Zhang W, Yao D, et al. L6H9 attenuates LPS-induced acute lung injury in rats through targeting MD2. Drug Dev Res. 2020;81:85-92.

Tai W, Xu Y, Ding J, Wu H, Du M, Qu X, et al. Fibrocytes Ameliorate Acute Lung Injury by Decreasing Inflammatory Cytokine and Chemokine Levels and Reducing Neutrophil Accumulation in the Lung. Cell Physiol Biochem. 2017;44:1526-36.

Liang Y, Yang N, Pan G, Jin B, Wang S, Ji W. Elevated IL-33 promotes expression of MMP2 and MMP9 via activating STAT3 in alveolar macrophages during LPS-induced acute lung injury. Cell Mol Biol Lett. 2018;31;23:52.

Mokrá, D. Acute lung injury - from pathophysiology to treatment. Physiol Res. 2020;31;69:S353-66.

Santa Cruz R, Villarejo F, Irrazabal C, Ciapponi A. High versus low positive end-expiratory pressure (PEEP) levels for mechanically ventilated adult patients with acute lung injury and acute respiratory distress syndrome. Cochrane Database Syst Rev. 2021;30;3:CD009098.

Mokra D, Mikolka P, Kosutova P, Mokry J. Corticosteroids in Acute Lung Injury: The Dilemma Continues. Int J Mol Sci. 2019;25;20:4765.

Patel VJ, Biswas Roy S, Mehta HJ, Joo M, Sadikot RT. Alternative and Natural Therapies for Acute Lung Injury and Acute Respiratory Distress Syndrome. Biomed Res Int. 2018;16;2018:2476824.

Krause DS, Van Etten RA. Tyrosine kinases as targets for cancer therapy. N Engl J Med. 2005;14;353:172-87.

Thompson AM, Rewcastle GW, Tercel M, Dobrusin EM, Fry DW, Kraker AJ, et al. Tyrosine kinase inhibitors. 1. Structure-activity relationships for inhibition of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase activity by 2,3-dihydro-2-thioxo-1H-indole-3-alkanoic acids and 2,2’-dithiobis(1H-indole-3-alkanoic acids). J Med Chem. 1993;20;36:2459-69.

Natoli C, Perrucci B, Perrotti F, Falchi L, Iacobelli S; Consorzio Interuniversitario Nazionale per Bio-Oncologia (CINBO). Tyrosine kinase inhibitors. Curr Cancer Drug Targets. 2010;10:462-83.

Tsutsumi T, Nagaoka T, Yoshida T, Wang L, Kuriyama S, Suzuki Y, et al. Nintedanib ameliorates experimental pulmonary arterial hypertension via inhibition of endothelial mesenchymal transition and smooth muscle cell proliferation. PLoS One. 2019;24;14:e0214697.

Varone F, Sgalla G, Iovene B, Bruni T, Richeldi L. Nintedanib for the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis. Expert Opin Pharmacother. 2018;19:167-75.

Richeldi L, du Bois RM, Raghu G, Azuma A, Brown KK, Costabel U, et al. Efficacy and safety of nintedanib in idiopathic pulmonary fibrosis. N Engl J Med. 2014;29;370:2071-82.

da Silva RF, Nogueira-Pangrazi E, Kido LA, Montico F, Arana S, Kumar D, et al. Nintedanib antiangiogenic inhibitor effectiveness in delaying adenocarcinoma progression in Transgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate (TRAMP). J Biomed Sci. 2017;12;24:31.

Yamashita M, Niisato M, Kawasaki Y, Karaman S, Robciuc MR, Shibata Y, et al. VEGF-C/VEGFR-3 signalling in macrophages ameliorates acute lung injury. Eur Respir J. 2022;14;59:2100880.

Li D, Ren W, Jiang Z, Zhu L. Regulation of the NLRP3 inflammasome and macrophage pyroptosis by the p38 MAPK signaling pathway in a mouse model of acute lung injury. Mol Med Rep. 2018;18:4399-409.

Kim HY, Kim MS, Kim SH, Joen D, Lee K. Protective Effects of Nintedanib against Polyhexamethylene Guanidine Phosphate-Induced Lung Fibrosis in Mice. Molecules. 2018;7;23:1974.

Pittet JF, Griffiths MJ, Geiser T, Kaminski N, Dalton SL, Huang X, et al. TGF-beta is a critical mediator of acute lung injury. J Clin Invest. 2001;107:1537-44.

Lorenz G, Darisipudi MN, Anders HJ. Canonical and non-canonical effects of the NLRP3 inflammasome in kidney inflammation and fibrosis. Nephrol Dial Transplant. 2014;29:41-8.

Guo H, Callaway JB, Ting JP. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 2015;21:677-87.

Ma HJ, Huang XL, Liu Y, Fan YM. Sulfur dioxide attenuates LPS-induced acute lung injury via enhancing polymorphonuclear neutrophil apoptosis. Acta Pharmacol Sin. 2012;33:983-90.

Chimenti L, Camprubí-Rimblas M, Guillamat-Prats R, Gomez MN, Tijero J, Blanch L, et al. Nebulized Heparin Attenuates Pulmonary Coagulopathy and Inflammation through Alveolar Macrophages in a Rat Model of Acute Lung Injury. Thromb Haemost. 2017;117:2125-34.

Aydin P, Magden ZBA, Uzuncakmak SK, Halici H, Akgun N, Mendil AS, et al. Avanafil as a Novel Therapeutic Agent Against LPS-Induced Acute Lung Injury via Increasing CGMP to Downregulate the TLR4-NF-κB-NLRP3 Inflammasome Signaling Pathway. Lung. 2022;200:561-72.

Liu Y, Zhou J, Luo Y, Li J, Shang L, Zhou F, et al. Honokiol alleviates LPS-induced acute lung injury by inhibiting NLRP3 inflammasome-mediated pyroptosis via Nrf2 activation in vitro and in vivo. Chin Med. 2021;29;16:127.

Matute-Bello G, Frevert CW, Martin TR. Animal models of acute lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2008;295:L379-99.

Yılmaz Sipahi E, Atalay F. Experimental Models of Acute Lung Injury. Eurasian J Pulmonol. 2014;16:69-77.

Chen H, Bai C, Wang X. The value of the lipopolysaccharide-induced acute lung injury model in respiratory medicine. Expert Rev Respir Med. 2010;4:773-83.

Wang X, Adler KB, Erjefalt J, Bai C. Airway epithelial dysfunction in the development of acute lung injury and acute respiratory distress syndrome. Expert Rev Respir Med. 2007;1:149-55.

Cheng DS, Han W, Chen SM, Sherrill TP, Chont M, Park GY, et al. Airway epithelium controls lung inflammation and injury through the NF-kappa B pathway. J Immunol. 2007;15;178:6504-13.

Kim HJ, Lee HS, Chong YH, Kang JL. p38 Mitogen-activated protein kinase up-regulates LPS-induced NF-kappaB activation in the development of lung injury and RAW 264.7 macrophages. Toxicology. 2006;225:36-47.

Tang J, Xu L, Zeng Y, Gong F. Effect of gut microbiota on LPS-induced acute lung injury by regulating the TLR4/NF-kB signaling pathway. Int Immunopharmacol. 2021;91:107272.

Shaukat A, Guo YF, Jiang K, Zhao G, Wu H, Zhang T, et al. Ginsenoside Rb1 ameliorates Staphylococcus aureus-induced Acute Lung Injury through attenuating NF-κB and MAPK activation. Microb Pathog. 2019;132:302-12.

Afonina IS, Zhong Z, Karin M, Beyaert R. Limiting inflammation-the negative regulation of NF-κB and the NLRP3 inflammasome. Nat Immunol. 2017;9;18:861-9.

Li J, Ma J, Li M, Tao J, Chen J, Yao C, et al. GYY4137 alleviates sepsis-induced acute lung injury in mice by inhibiting the PDGFRβ/Akt/NF-κB/NLRP3 pathway. Life Sci. 2021;15;271:119192.

Fan Z, Yao J, Li Y, Hu X, Shao H, Tian X. Anti-inflammatory and antioxidant effects of curcumin on acute lung injury in a rodent model of intestinal ischemia reperfusion by inhibiting the pathway of NF-Kb. Int J Clin Exp Pathol. 2015;1;8:3451-9.

Jo EK, Kim JK, Shin DM, Sasakawa C. Molecular mechanisms regulating NLRP3 inflammasome activation. Cell Mol Immunol. 2016;13:148-59.

Kim EH, Park MJ, Park S, Lee ES. Increased expression of the NLRP3 inflammasome components in patients with Behçet’s disease. J Inflamm (Lond). 2015;2;12:41.

Miller LS, Pietras EM, Uricchio LH, Hirano K, Rao S, Lin H, et al. Inflammasome-mediated production of IL-1beta is required for neutrophil recruitment against Staphylococcus aureus in vivo. J Immunol. 2007;179:6933-42.

Cohen TS, Prince AS. Activation of inflammasome signaling mediates pathology of acute P. aeruginosa pneumonia. J Clin Invest. 2013;123:1630-7.

Mishra BB, Moura-Alves P, Sonawane A, Hacohen N, Griffiths G, Moita LF, et al. Mycobacterium tuberculosis protein ESAT-6 is a potent activator of the NLRP3/ASC inflammasome. Cell Microbiol. 2010;12:1046-63.

Allen IC, Scull MA, Moore CB, Holl EK, McElvania-TeKippe E, Taxman DJ, et al. The NLRP3 inflammasome mediates in vivo innate immunity to influenza A virus through recognition of viral RNA. Immunity. 2009;30:556-65.

Du ZA, Sun MN, Hu ZS. Saikosaponin a Ameliorates LPS-Induced Acute Lung Injury in Mice. Inflammation. 2018;41:193-8.

Wang L, Lei W, Zhang S, Yao L. MCC950, a NLRP3 inhibitor, ameliorates lipopolysaccharide-induced lung inflammation in mice. Bioorg Med Chem. 2021;30:115954.

Afonina IS, Zhong Z, Karin M, Beyaert R. Limiting inflammation-the negative regulation of NF-κB and the NLRP3 inflammasome. Nat Immunol. 2017;18:861-9.

Jordan JA, Guo RF, Yun EC, Sarma V, Warner RL, Crouch LD, et al. Role of IL-18 in acute lung inflammation. J Immunol. 2001;167:7060-8.

Kuipers MT, Aslami H, Janczy JR, van der Sluijs KF, Vlaar AP, Wolthuis EK, et al. Ventilator-induced lung injury is mediated by the NLRP3 inflammasome. Anesthesiology. 2012;116:1104-15.

Wu J, Yan Z, Schwartz DE, Yu J, Malik AB, Hu G. Activation of NLRP3 inflammasome in alveolar macrophages contributes to mechanical stretch-induced lung inflammation and injury. J Immunol. 2013;190:3590-9.

Mulligan MS, Ward PA. Immune complex-induced lung and dermal vascular injury. Differing requirements for tumor necrosis factor-alpha and IL-1. J Immunol. 1992;149:331-9.

Wollin L, Distler JHW, Redente EF, Riches DWH, Stowasser S, Schlenker-Herceg R, et al. Potential of nintedanib in treatment of progressive fibrosing interstitial lung diseases. Eur Respir J. 2019;54:1900161.

Oyaizu T, Fung SY, Shiozaki A, Guan Z, Zhang Q, dos Santos CC, et al. Src tyrosine kinase inhibition prevents pulmonary ischemia-reperfusion-induced acute lung injury. Intensive Care Med. 2012;38:894-905.

El-Agamy DS. Nilotinib ameliorates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats. Toxicol Appl Pharmacol. 2011;253:153-60.

Mura M, dos Santos CC, Stewart D, Liu M. Vascular endothelial growth factor and related molecules in acute lung injury. J Appl Physiol (1985). 2004;97:1605-17.

Jo YY, Kim DW, Choi JY, Kim SG. 4-Hexylresorcinol and silk sericin increase the expression of vascular endothelial growth factor via different pathways. Sci Rep. 2019;9:3448.

Wollin L, Maillet I, Quesniaux V, Holweg A, Ryffel B. Antifibrotic and anti-inflammatory activity of the tyrosine kinase inhibitor nintedanib in experimental models of lung fibrosis. J Pharmacol Exp Ther. 2014;349:209-20.

Sıçanlarda Lipopolisakkarid Kaynaklı Akut Akciğer Hasarı Modelinde Nintedanibin NLRP3 Yoluyla Akciğerler Üzerindeki Etkileri